微生物的染色方法

任务3　微生物的染色方法

1．染色步骤

细菌染色的基本步骤为：涂片→干燥→固定→染色。

（1）涂片。根据标本性质和检验目的不同，涂片方法亦不同。

一般的方法是：①取一清洁无油脂的载玻片，加一滴生理盐水（如为液体标本或液体培养物可不加盐水）；②用灭菌的接种环取菌落（纯培养者可取菌苔）少许，与生理盐水混匀，涂成薄膜，液体培养物可立即挑取菌液涂片。

（2）干燥。一般在室温中使自然干燥。若需加速干燥，可在火焰上方的热空气中加温干燥，但切勿紧靠火焰，以免标本烤焦。

（3）固定。固定的目的包括：使细菌的细胞质凝固，杀死细菌；使菌体与玻片黏附牢固；改变菌体对染料的通透性。一般均用加热法，即将涂片迅速通过火焰2～3次，将玻片反面接触皮肤，以热而不烫为宜。

（4）染色。根据检验目的不同，可选用不同的染色方法进行染色。滴加染液，以覆盖标本为宜。

（5）媒染。媒染的目的主要为增强菌体与染液间的作用力，其方法根据各种染色方法而异，有加热、金属盐、碘等。

（6）脱色。目的在于测知染料与被染物之间结合的牢固程度，方法是将脱色剂（例如酒精和酸等）滴加于经过染色的标本上，作用一定时间后除去脱色剂。

（7）复染。目的在于使已脱色的菌体重新染上与前染液颜色呈明显对比的颜色。

（8）标本的保存与封片法。观察细菌染色标本均用油镜，如需要保留标本，可于观察后用擦镜纸沾二甲苯轻轻将镜油擦去。如需长期保存，最好在标本中央加一滴加拿大树胶，上覆一洁净盖玻片，待其自然干燥后，保存于标本盒内，可多年不变色。

2．染色方法

染色方法包括单染色法和复染色法两类。单染色法即只用一种染料对细菌着色，此法操作简便，但一般只能显示菌体的形态，功能较单一。复染色法是使用两种及两种以上染料对细菌染色，常用的方法有革兰氏染色法和抗酸性染色法等，除了着色及增加反差外，还能对微生物种类作出初步判断。对于细菌的一些特殊结构如芽孢、鞭毛等用普通染色方法处理时往往效果很差，难以观察，应采用特殊的方法处理。

1）简单染色法

简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形状的观察。常用碱性染料进行简单染色。

简单染色法常用染液为碱性美蓝染液或石炭酸复红染液。操作过程如下：涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥（晾干）→镜检。涂片、干燥、固定操作见图2－1，无菌操作过程见图2－2。

图2－1　涂片、干燥、固定操作

图2－2　无菌操作过程

2）鉴别染色法

（1）革兰氏染色法。

原理：革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法，通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G＋）和革兰氏阴性菌（G－）两大类。一般认为革兰氏阳性菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰氏阴性菌的肽聚糖层很薄，类脂质含量高，经乙醇处理后部分细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径变大，经脱色剂脱色后，能将结晶紫与碘的复合物洗去，而保留复染的颜色。

革兰氏染色所用的四种不同染液和作用介绍如下。

①初染剂（碱性染液）：在碱性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明对比，在显微镜下更易于识别。常用的初染剂为草酸铵结晶紫染液。

②媒染剂：其作用是增强染料与细菌的亲和力，更好地加强染料与细胞的结合。常用的媒染剂是碘液。

③脱色剂：帮助染料从被染色的细胞中脱色。利用细菌对染料脱色的难易程度不同，从而对细菌加以区分。常用的脱色剂是丙酮或乙醇（一般为95%乙醇）。

④复染剂：一种碱性染料，目的是使脱色的细菌重新染上另一种颜色，以便与未脱色细菌进行比较。常用的复染剂为番红染液。操作过程（图2－3）：

需要注意的是脱色是革兰氏染色中关键的一步，乙醇的浓度、用量、脱色时间及涂片厚度都会影响脱色速度和脱色效果。

结果：革兰氏阳性菌染成紫色，革兰氏阴性菌染成红色。

（2）抗酸性染色法。

抗酸性染色法是鉴别抗酸性杆菌与非抗酸性杆菌的重要方法。

染液：石炭酸复红染液、3%盐酸乙醇溶液、吕氏碱性美蓝溶液。

操作过程：

图2－3　革兰氏染色操作

（a）用结晶紫染色；（b）用自来水冲洗；（c）用碘液媒染；（d）用自来水冲洗；

（e）用95%乙醇脱色；（f）用自来水冲洗；（g）用番红复染；（h）用自来水冲洗；（i）吸干水分

结果：结核杆菌（抗酸性）染成红色，其他细菌（非抗酸性）或细胞染成蓝色。

3）特殊染色法

（1）芽孢染色法。

原理：芽孢染色法是根据细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同，用不同的染料进行染色，使芽孢和菌体呈不同颜色而便于区别。芽孢壁厚，通透性低，着色、脱色较困难，当用弱碱性染料在加热的情况下进行染色时，染料可以进入菌体及芽孢使其着色，而进入芽孢的染料则难以透出。若再复染（番红），则菌体呈红色而芽孢呈绿色。

染液：5%饱和孔雀绿染液、0．5%番红染液。

操作过程：

挑取菌种进行涂片、干燥、固定；取一片小于载玻片的滤纸，将其覆盖在涂片标本上；在滤纸片上滴加孔雀绿染液，用蒸汽加热5～10min，注意及时补加染液，防止蒸干；取下纸片，待玻片冷却后水洗；滴加番红染液复染30s，水洗，干燥，镜检。

结果：芽孢染色成绿色，菌体染成红色。

（2）荚膜染色法。

原理：荚膜是包围在细菌细胞外的一层黏液状或胶质状物质，其成分为多糖、糖蛋白或多肽。由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色，而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去，所以观察荚膜时通常采用负染色法，即将菌体染色后再使背景着色，从而把荚膜衬托出来。由于荚膜含水量高，制片时通常不用热固定，以免使荚膜变形影响观察。

染液：5%黑色素水溶液、番红染液。

操作过程：

滴一滴黑色素溶液于干净的载玻片一端，挑取菌种与其混合；另取一干净的载玻片将此混合物自玻片一端刮至另一端，使之形成一薄层（图2－4）；自然干燥，轻热固定；加番红染液染色30s，水洗，干燥，镜检。

图2－4　涂片及推片方法

结果：菌体呈红色，背景呈黑色，荚膜无色。

（3）鞭毛染色法。

原理：细菌的鞭毛非常纤细，其直径为10～12nm，超过了一般光学显微镜的分辨率。因此在染色时，不仅要使鞭毛染色，还要使一部分染料堆积在鞭毛上，加粗鞭毛的直径，便于在光学显微镜下进行观察。

鞭毛染色方法很多，但染色成功的关键一是必须使用新鲜培养、运动活泼的菌体进行染色，二是使用清洁无油的玻片，使菌液流过玻片时能迅速展开，保持细菌的自然形态。

染液：A液为单宁酸，FeCl₃，15%甲醛（福尔马林），1%NaOH溶液，蒸馏水；B液为2%AgNO₃溶液。

操作过程：

①载玻片的清洗。将载玻片在洗衣粉水中煮沸约20min，后用清水充分洗净，沥干水后置95%乙醇中，用时取出在火焰上烧去乙醇即可。玻片要求光滑、洁净，尤其忌用带油迹的玻片（将水滴在玻片上，无油迹玻片上水能均匀散开）。

②菌种的准备。实验宜用新培养的菌体，斜面菌种应连续移接3～5次后再使用。

③制片。在清洁的玻片一端滴一滴蒸馏水，用接种环挑取少量菌体（勿带出培养基），于水滴中轻蘸几下（勿涂布），然后将载玻片倾斜，使菌液流至另一端，再放平，自然干燥（勿加热）。

④染色。滴加鞭毛染色A液染色2～3min，水洗，将残水沥干，或用鞭毛染色B液冲去残水，然后滴加B液，将载玻片稍加热，染色30～60s，冷却后水洗。注意：一定要将A液充分洗净后再加B液。

⑤镜检。干燥后用油镜观察。

结果：菌体呈深褐色，鞭毛显褐色，通常呈波浪形。