培养基的配制与灭菌

培养基的配制与灭菌_微生物实验实训

实训1　培养基的配制与灭菌

一、实训目的

（1）了解培养基的配制原理。

（2）掌握配制培养基的一般方法和步骤。

二、实训原理

经人工配制适合微生物生长发育的营养基质称为培养基。良好的培养基应具备合理配比的各种营养物质、适合的pH和一定的缓冲能力，以及一定的氧化还原电位和合适的渗透压。

按照成分分类，培养基可分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。天然培养基是由化学成分不完全了解的植物性或动物性材料，如马铃薯、麦芽汁、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨等配制而成；合成培养基是由已知成分的纯化学药品配制成的。此外还有二者混合配制的半合成培养基。

培养基可制成液体、固体和半固体。在液体培养基中加入凝固剂，即可制成固体与半固体的培养基。常用的凝固剂是琼脂（也叫洋菜），它是由海藻中的石花菜加工制成的藻胶，成分主要为多糖类物质，其次含少量的CaO、MgO，性质较稳定，一般微生物不能分解利用。琼脂是一种可逆胶体，加热至96℃以上时呈溶胶状态，温度冷却到45℃以下时则凝结成为固体，所以琼脂是微生物实验技术上理想的凝固剂。固体培养基中琼脂的加入量为15～20g／L，半固体培养基的加入量为3～6g／L。

培养基可用于微生物的分离、纯化、培养、保存和菌种鉴定等方面，掌握培养基的制备是微生物实验中最基本的技术之一。

三、实训器材

1．材料

新鲜马铃薯、蔗糖（葡萄糖）、牛肉膏、蛋白胨、可溶性淀粉、黄豆芽、NaCl、KNO₃、K₂HPO₄、MgSO₄·7H2O、FeSO₄·7H2O、NaNO₃、KCl、1mol／L　NaOH溶液、1mol／L盐酸、水、琼脂等。

2．器具

小铝锅、电炉、托盘天平、试管、150mL与250mL锥形瓶、9cm培养皿、1mL与10 mL吸管、烧杯、量筒、试管架、漏斗、乳胶管、弹簧夹、纱布、棉花、牛皮纸、线绳、菜板、小刀、pH试纸、药匙、玻璃棒、高压蒸汽灭菌锅等。

四、实训步骤

制备培养基的基本程序为：药品称量→加水溶解→调pH→过滤、分装→塞棉塞→包扎→灭菌→无菌检查。

1．牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（培养细菌用）配方：牛肉膏　　　　　　3．0g

蛋白胨10．0g

蒸馏水1000mL

NaCl　5．0g

琼脂15～20g

pH　7．0～7．2

制备方法：

（1）在小铝锅中加入一定量的（150mL）水，于锅内壁贴湿纸条一个，使纸条下端与液面相接触，即为液面高度的标记，在电炉上加热。

（2）称取琼脂，用水洗净后放入锅中煮沸，用玻璃棒不断搅拌以免锅底烧焦，随时注意勿溢出锅外，加热至琼脂完全融化。

（3）用一小片称样纸（或表面皿）称取牛肉膏，连同称样纸一起投入水中，待牛肉膏溶解后，捞出称样纸弃去。另取一张称样纸称取蛋白胨、NaCl倒入锅中，加热溶解，搅匀，并加水补足因蒸发而失去的水分。

（4）用玻璃棒沾少许液体，测定pH，用1mol／L　NaOH溶液或1mol／L盐酸调pH至7．0～7．2。

（5）趁热用漏斗分装于试管中，分装试管的量以试管高度的1／4左右为宜。共装6～8只，剩余培养基装入150mL锥形瓶中（供分离用）。分装时勿使培养基沾污管口或瓶口，以免浸湿棉塞，引起杂菌污染（图3－1）。

（6）分装完毕后塞上棉塞，包一层牛皮纸，用线绳扎紧，以防灭菌时凝结水浸湿棉塞。捆扎好后写上标签，放入高压蒸汽灭菌锅中，0．105MPa（121℃）灭菌30min。灭菌完毕，将制作的培养基试管趁热摆成斜面（图3－2），斜面长度以不超过试管长的1／2为宜。待培养基冷凝后，注明名称、制作日期等。

图3－1　培养基分装装置

（a）漏斗分装装置；（b）自动分装器1—铁架；2—漏斗；3—乳胶管；4—弹簧夹；5—玻管；6—流速调节；7—装量调节；8—开关

图3－2　搁置斜面

（7）灭菌后的培养基放入37℃培养箱中培养24h，以检验灭菌的效果，无污染才可使用。

2．马铃薯蔗糖（葡萄糖）琼脂培养基（培养各种真菌）

配方：马铃薯（去皮）200g

蔗糖（葡萄糖）20g

蒸馏水1000mL

琼脂15～20g

pH自然

制备方法：

（1）称取去皮的马铃薯200g，切成1cm见方小块放入小铝锅中，加入1000mL水，置电炉上煮沸30min。然后用4层纱布过滤，滤液倒入小铝锅中继续煮沸。

（2）加入称量好的蔗糖（葡萄糖）、琼脂，加热搅拌至琼脂完全熔化，并补足水量至1000mL。

（3）趁热用漏斗分装于锥形瓶和试管中，分装的量以不超过锥形瓶容积的1／2为宜。分装完毕后塞上棉塞，捆扎好并写上标签。

（4）0．105MPa（121℃）灭菌30min。

3．高氏I号培养基（培养放线菌）

配方：可溶性淀粉20．0g

KNO₃1．0g

NaCl　0．5g

K₂HPO₄0．5g

MgSO₄·7H₂O　0．5g

FeSO₄·7H2O　0．01g

琼脂15～20g

蒸馏水1000mL

pH　7．2～7．4

各盐类（KNO₃、NaCl、K₂HPO₄、MgSO₄·7H2O、FeSO₄·7H2O）需预先配成10g／L浓度使用。

制备方法：

（1）量取20mL或30mL蒸馏水倒入150mL锥形瓶中，按K₂HPO₄→MgSO₄·7H2O→KNO₃→FeSO₄·7H2O→NaCl的顺序吸取各盐溶液（按需要的总量提前算好）加入锥形瓶中，边加边搅匀。

（2）称取可溶性淀粉，先用冷水调成糊状，加入锥形瓶中摇匀。

（3）称取琼脂，用水洗净，挤出多余的水分，投入瓶中。

（4）减去预先加入锥形瓶的蒸馏水及各盐溶液所占的体积，再加蒸馏水补足。

（5）先用pH试纸测pH，然后塞棉塞，包扎。

（6）0．105MPa（121℃）灭菌30min。

4．察氏（Czapek’s）培养基（培养霉菌用）配方：蔗糖30．0g

NaNO₃3．0g

K₂HPO₄1．0g

MgSO₄·7H2O　0．5g

FeSO₄·7H2O　0．01g

KCl　0．5g

琼脂15～20g

蒸馏水1000mL

pH自然

各盐类需预先配成10g／L浓度便于使用。分离真菌时，于临用前加入0．3%的灭菌乳酸，使pH降为4．5。

制备方法：

（1）取50mL蒸馏水于250mL烧杯中，按K₂HPO₄→MgSO₄·7H2O→NaNO₃→FeSO₄·7H2O→KCl的顺序加入各盐溶液（或固体试剂），使其混匀。

（2）以蒸馏水将溶液补足至总体积，装入锥形瓶中，按比例加入糖及琼脂，塞棉塞，包扎。

（3）0．105MPa（121℃）下灭菌30min。

5．豆芽汁蔗糖琼脂培养基（培养霉菌、酵母菌）

配方：豆芽汁1000mL

蔗糖20．0g

琼脂15～20g

pH　7．2

分离真菌时，于临用前加入0．3%的灭菌乳酸，使pH降为4．5。

制备方法：

（1）称取洗净的黄豆芽200g，加水1000mL，煮沸30min，纱布过滤，取汁液，加水补足总量，制成豆芽汁备用。

（2）量取豆芽汁一份，放入锥形瓶中，按比例加入蔗糖、琼脂，调pH，加棉塞，包扎，灭菌。

（3）0．105MPa（121℃）灭菌30min。

五、思考题

（1）配制培养基时应注意什么问题？为什么？

（2）培养基配好后为什么要立即灭菌？

（3）为什么管口、瓶口要加塞棉塞？制作棉塞的方法和要求是什么？

（4）斜面培养基如何制作？分装时应注意什么问题？

（5）分析分离用培养基各成分的作用，指明其适合于培养何种营养类型的微生物。