实训2 微生物的接种
一、实训目的
（1）掌握常用微生物接种技术。
（2）熟悉无菌操作环节。
二、实训原理
接种是微生物实验技术中最基本的操作，即把已获得的纯种微生物于无菌条件下移植于新鲜的无菌培养基的过程。在微生物的菌种保藏、分离培养、鉴定菌种及形态生理等的研究中，都必须进行接种。接种时必须严格执行无菌操作，防止外界杂菌污染，保证纯培养的技术操作。若操作不慎污染了杂菌，将导致实验失败或损坏菌种。
微生物接种因实验目的、培养基种类及容器的不同，所用接种方法不同。常用的接种方法有：斜面接种、液体接种、平板划线接种和穿刺接种。
三、实训器材
1．菌种
大肠杆菌、葡萄球菌斜面菌种。
2．培养基
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（斜面、液体、柱状、平板等）。
3．器具
恒温培养箱、接种环、接种针、接种钩、镊子、培养皿、试管、酒精灯、试管架、标签纸、消毒剂等。
四、实训步骤
（一）接种前的准备
1．无菌室的准备
小规模的接种操作一般使用无菌接种箱或超净工作台；工作量大的使用无菌室接种，配合使用超净工作台。
2．接种工具的准备
最常用的接种工具是接种环，此外还有接种针、接种钩等（图3－3）。
图3－3 常用接种工具
1—玻璃刮铲；2—滴管；3—移液管；4—接种针；5—接种环
3．接种材料的准备
将欲接种的培养基试管或平板贴好标签，同其他用品放在操作台上摆好。
4．环境消毒
无菌室或工作台使用前需打开紫外灯照射30min，操作时关闭紫外灯。接种人员操作前还需换好隔离工作服、鞋、帽，戴上口罩，将手清洗消毒。
（二）接种方法
1．斜面接种技术
斜面接种是从已经生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植到另一支新鲜斜面培养基上的一种接种方法，具体操作如下。
（1）点燃酒精灯：操作前先用75%酒精擦手，待酒精挥发后点燃酒精灯，灯焰周围1～2cm处的空间为无菌区，在此区域接种可避免杂菌污染。
（2）手持试管：将菌种和待接斜面的两支试管如图3－4所示握在左手中，斜面向上，保持水平。
图3－4 斜面接种与液体接种
（a）斜面接种；（b）液体接种
（3）取接种环：右手拿接种环，在火焰上将环端及可能伸入试管的部分烧红灭菌。
（4）拔棉塞：用右手的无名指和小指先后拔出菌种管和待接试管的棉塞，让试管口缓缓过火灭菌。
（5）取菌种：将灼烧过的接种环伸入菌种管，先接触管壁或未长菌的培养基使其冷却。待冷却后轻轻蘸取少量菌种或孢子，移出菌种管。
（6）接种：在火焰旁边迅速将蘸有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培养的底部向上部作“Z”字形来回密集划线，注意不要划破培养基斜面。
（7）塞棉塞：取出接种环，灼烧试管口，在火焰旁边塞上棉塞。
（8）环灭菌：将接种环烧红灭菌，放好。
（9）培养：进一步将棉塞塞紧，置28℃下培养2～3天，进行观察。
2．液体接种技术
液体接种是将纯微生物接入液体培养基的方法。在测定微生物生理特性及其代谢产物，以及进行扩大培养时，常需将菌种接在液体培养基内进行培养。
（1）斜面菌种接种液体培养基：如接种量小，可用接种环取少量菌体移入待接培养基中，在器壁上摩擦，把菌苔研开。抽出接种环，塞上棉塞，轻轻摇晃液体，让菌体均匀分布；如接种量大，可先在斜面菌种管中倒入定量无菌水，用接种环把菌苔刮下研开，再把菌悬液在火焰旁边倒入液体培养基中，注意倒前需将试管口在火焰上灭菌。
（2）液体菌种接种液体培养基：菌种是液体时，可用无菌的滴管或移液管吸取菌液接种到液体培养基，接种时在火焰旁拔出棉塞，将管口通过火焰，也可直接把液体培养物倒入液体培养基中（图3－4），摇匀即可。
3．平板接种法
平板接种即用接种环将菌种接至平板培养基上，或用吸管接种定量的菌液至平板培养基上，再用无菌刮铲刮匀，然后培养。观察菌落形态、分离纯化菌种、活菌技术等常采用此方法。
1）斜面接平板
（1）划线法：用接种环以无菌操作法从斜面菌苔上挑取或以菌悬液接种。方法是用左手托起培养基平板，以拇指和食指夹住皿盖两侧，其余三个手指托住皿底，拇指稍向上掀盖即可打开一缝隙，右手把已取好菌的接种环迅速由缝隙深入平板内，在培养基一侧作第一次平行的（或连续的）划线4～5条，然后取出接种环灼烧，左手随即将皿盖合上。将培养皿向左旋转60°，按上法作第二次划线，划线时接种环必须通过第一次划过的一条或两条线，稀释第一次接种的细胞，划3～4条。再将培养皿转约60°，灼烧接种环后作第三次划线，亦可作第四次划线（图3－5）。接种完毕，灼烧接种环，将培养皿倒置于28℃下培养2～3天。
图3－5 划线分离法
（a）交叉划线分离法；（b）连续划线分离法1～4表示划线起始和终止位置
（2）点接法：一般观察霉菌或酵母菌的较大菌落时多采用此方法。用接种环取菌体后，于平板上以三点的形式接种，由于霉菌孢子轻，易飞扬，宜先制成孢子悬浮液，再进行接种。
2）液体接平板
用灭菌吸管或滴管吸取定量的菌液滴至平板培养基上，然后用无菌刮铲涂匀后，倒置于28℃下培养。此法常用于微生物的分离、测数。
3）平板接斜面
将平板上分离得到的单菌落按无菌操作的方法分别移接到斜面培养基上以保存菌种。接种前，先选好典型单菌落，做好标记。以左手托住培养皿，并用拇指与食指掀起皿盖成缝隙，将灼烧过的接种环伸至菌落边的空白培养基处接触冷却，挑菌后移出接种环（靠近火焰无菌区），左手放下培养皿，换拿一只斜面培养基按斜面接种法进行接种。接种完毕，置于28℃下培养2～3天后观察结果。
4．穿刺接种技术
穿刺接种是一种用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体，并把它穿刺接种到固体或半固体的深层培养基中的方法，适合于厌氧性细菌和酵母菌的接种培养。它常作为保藏菌种的一种接种方法，同时也可用于检查细菌的运动能力。具有运动能力的细菌，一般能沿着穿刺线向外运动而生长，故形成的菌条粗；不能运动的细菌则仅能在穿刺线上生长，故所形成的菌条纤细。穿刺接种具体操作如下。
图3－6 穿刺接种法
（a）垂直法；（b）水平法
（1）手持试管，旋松棉塞。
（2）取接种针，灼烧灭菌。
（3）拔塞取菌：用右手的无名指和小指拔出棉塞，将灼烧过的接种针伸入菌种管，先接触管壁或未长菌的培养基让其冷却。待冷却后轻轻蘸取少量菌或孢子，移出菌种管。
（4）穿刺接种：有两种手持操作法（图3－6），一种是水平法，一种是垂直法。穿刺时将接种针自培养基中心垂直刺入培养基中，直到接近试管底部，但勿穿透，然后沿着接种线将针拔出。穿刺时手要稳，动作要轻，速度要快。最后塞上棉塞，将接种针上残留的菌在火焰上烧掉。
（三）培养
将接种过的试管或培养皿放在恒温培养箱中培养，24h后观察并记录结果。
五、思考题
（1）以斜面接种技术为例写出接种全过程。
（2）根据培养结果分析接种过程中应注意的关键技术环节。
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