实训39 食品卫生微生物检验
一、实训目的
（1）学习食品卫生微生物检验的一般程序。
（2）熟练掌握平板菌落计数法和乳糖发酵法。
（3）了解各种食品的国家卫生标准。
二、实训原理
食品微生物检验是研究食品中微生物的种类、分布、生物学特性、流行病学特点、微生物作用机理及检验方法的一门技术科学，主要研究食品的污染与检测范围、卫生指标和检验方法。
食品卫生微生物检验一般检验食品的菌落总数、大肠菌群、霉菌和酵母菌、致病菌等指标。
菌落总数是食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得1g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。菌落总数不能区别其中细菌的种类，所以也被称作杂菌数、需氧菌数等。食品在生产、加工、运输、储藏等过程中都有可能受到各种各样的细菌污染。细菌可在食品中繁殖而引起食品腐败变质。菌落总数主要是用来作为判定食品被细菌污染程度的指标。食品中细菌数的多少，不仅可以反映出食品被污染的程度，而且也反映出食品的新鲜程度和食品生产的一般卫生状况等，因此该项指标是判定食品卫生质量的一项重要依据。
大肠菌群是粪便污染的指标菌。粪便是人、畜肠道排泄物，其中有健康人畜的粪便，也有肠道患者或肠道病原携带者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也含有一些肠道致病菌（如沙门氏菌、志贺氏菌和肠道病毒等）。大肠菌群包括大肠埃希氏菌属、枸橼酸菌属、克雷伯氏菌属、阴沟肠杆菌以及其他一些需氧及兼性厌氧、在37℃24h能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群分解乳糖产酸产气，但产气量的多少与菌型、菌量的多少和样品种类有关。在伊红美蓝平板上，该菌群的菌落均为光滑湿润或干燥两类，边缘整齐，但菌落的颜色有很大的差异，呈深紫黑色有金属光泽或呈粉红色，一般呈深紫黑色有金属光泽的菌落检出率较高。食品中检出大肠菌群，说明该食品近期或远期受到粪便的污染，也可能有肠道病原菌的存在。大肠菌群数检出的高低，表明粪便污染的程度、食品卫生的质量和对人体健康危害性的大小。不同食品大肠菌群的卫生标准是不同的，采用最可能数MPN进行大肠菌群计数，MPN是基于泊松分布的一种间接计数方法。一般要求大多数食品1g（mL）大肠菌群的最可能数小于3或小于30。
食品中致病菌的检验包括食品中肠道致病杆菌（沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌）的检验、致病性球菌（金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌）的检验和其他致病菌（副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、空肠弯曲菌、变形杆菌、肉毒梭菌及肉毒毒素、产气荚膜梭状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、椰毒假单胞菌酵米面亚种、单核细胞增生李斯特氏菌）的检验。
食品中真菌的检验包括食品中酵母菌和霉菌的检验。本实训只检验食品企业通常检验的项目菌落总数和大肠菌群数。
三、实训器材
1．设备
超净工作台，高压蒸汽灭菌锅，电炉，恒温水浴锅，微波炉，菌落计数器，生化培养箱，均质器。
2．仪器与用具
φ90mm培养皿，锥形瓶（250mL、500mL），吸管（1mL、10mL），试管，烧杯，玻璃棒，量筒，天平，研钵，均质杯或均质袋，记号笔。
3．培养基与试剂
平板计数琼脂培养基，月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤，NaCl，SiO2。
4．检验样品
块状食品（如糕点、加工肉制品、方便面、果冻等）；粉状食品（如奶粉、婴儿米粉、固体饮料等）；液态食品（果汁饮料、碳酸饮料、鲜牛奶等）。
四、实训步骤
（一）实训准备
1．选择检样为块状食品
（1）手术剪1把，包扎。
（2）研钵和适量石英砂（SiO2），包扎。
（3）称量纸若干，包扎。
（4）装400mL生理盐水的锥形瓶1瓶，包扎。
（5）500mL烧杯1个，试管3支，100mL量筒1个，分别包扎。
（6）1mL吸管4支，10mL吸管2支，玻璃棒1支，分别包扎。
（7）φ90mm培养皿10个，包扎。
（8）平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基200mL 1瓶，包扎。
平板计数琼脂培养基的配方：胰蛋白胨5．0g，酵母浸膏2．5g，葡萄糖1．0g，琼脂15．0g，蒸馏水1000mL，pH 7．0±0．2。
平板计数琼脂培养基的制法：将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH，分装到锥形瓶中。
（9）10mL双料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤3支，10mL单料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤6支，每支倒置小倒管，包扎。
月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤配方：胰蛋白胨或胰酪胨20．0g，氯化钠5．0g，乳糖5．0g，磷酸氢二钾2．75g，磷酸二氢钾2．75g，月桂基硫酸钠0．1g，蒸馏水1000mL，pH 6．8±0．2。
月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤制法：将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH，分装。
单料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤：依照月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤配方和制法配制。
双料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤：依照月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤配方，加水量不变，其他成分称量量加倍。
（10）配制煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤，配制试管支数依据初发酵结果确定，包扎。
煌绿乳糖胆盐肉汤配方：蛋白胨10．0g，乳糖10．0g，牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液200mL，0．1%煌绿水溶液13．3mL，蒸馏水800mL，pH 7．2±0．1。
煌绿乳糖胆盐肉汤制法：将蛋白胨、乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL（将20．0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，调节pH至7．0～7．5），用蒸馏水稀释到975mL，调节pH，再加入0．1%煌绿水溶液13．3mL，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。
其中，（1）、（2）、（3）、（4）、（5）、（6）、（7）准备好后，置于121℃高压灭菌20min，（8）、（9）、（10）置于121℃高压灭菌15min。
2．选择检样为粉状食品
（1）称量纸若干，金属药匙1把，分别包扎。
（2）装400mL生理盐水的锥形瓶1瓶，包扎。
（3）500mL烧杯1个，试管3支，100mL量筒1个，分别包扎。
（4）1mL吸管4支，10mL吸管2支，玻璃棒1支，分别包扎。
（5）φ90mm培养皿10个，包扎。
（6）平板计数琼脂培养基200mL 1瓶，包扎。
（7）10mL双料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤3支，10mL单料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤6支，每支倒置小倒管，包扎。
（8）煌绿乳糖胆盐肉汤：配制试管支数依据发酵结果确定，包扎。
其中，（1）、（2）、（3）、（4）、（5）准备好后，置于121℃高压灭菌20min，（6）、（7）、（8）置于121℃高压灭菌15min。
3．选择检样为液态食品
1）检样为非碳酸饮料
（1）装400mL生理盐水的锥形瓶1瓶，包扎。
（2）500mL烧杯1个，试管3支，100mL量筒1个，分别包扎。
（3）1mL吸管4支，10mL吸管2支，玻璃棒1支，分别包扎。
（4）φ90mm培养皿10个，包扎。
（5）平板计数琼脂培养基200mL 1瓶，包扎。
（6）10mL双料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤3支，10mL单料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤6支，每支倒置小倒管，包扎。
（7）煌绿乳糖胆盐肉汤：配制试管支数依据发酵结果确定，包扎。
其中，（1）、（2）、（3）、（4）准备好后，置于121℃高压灭菌20min，（5）、（6）、（7）置于121℃高压灭菌15min。
2）检样为碳酸饮料
（1）装400mL生理盐水的锥形瓶1瓶，包扎。
（2）500mL烧杯1个，试管3支，100mL量筒1个，分别包扎。
（3）1mL吸管4支，10mL吸管2支，玻璃棒1支，分别包扎。
（4）φ90mm培养皿10个，包扎。
（5）平板计数琼脂培养基200mL 1瓶，包扎。
（6）10mL双料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤3支，10mL单料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤6支，每支倒置小倒管，包扎。
（7）煌绿乳糖胆盐肉汤：配制试管支数依据发酵结果确定，包扎。
（8）500mL磨口瓶1个，纱布1块，包扎。
其中，（1）、（2）、（3）、（4）、（8）准备好后，置于121℃高压灭菌20min，（5）、（6）、（7）置于121℃高压灭菌15min。
（二）操作步骤
1．检样前处理
1）检样为块状食品
先将外包装表面用75%酒精棉擦拭消毒，以无菌操作开封，用无菌剪刀剪取检样25 g，放入灭菌研钵中剪碎，用灭菌石英砂研磨后，用灭菌生理盐水225mL制成均匀的1∶10稀释液。最好将25g检样置于盛有225mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8000～10000r／min均质1～2min，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，制成1∶10的样品匀液。
2）检样为粉状食品
先将外包装表面用75%酒精棉擦拭消毒，以无菌操作开封，称取检样25g，放入500 mL烧杯中，加入灭菌生理盐水225mL，用灭菌玻璃棒充分搅拌，使溶解均匀，得1∶10稀释液。最好将25g检样置于盛有225mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8000～10000r／min均质1～2min，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，制成1∶10的样品匀液。
3）检样为液态食品
（1）检样为非碳酸饮料。
先用75%酒精棉擦拭瓶口消毒，以无菌操作开盖，用灭菌吸管吸取检样25mL，放入500mL烧杯中，加入灭菌生理盐水225mL，用灭菌玻璃棒充分搅拌，使溶解均匀，得1∶10稀释液。或以无菌吸管吸取25mL检样置盛有225mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1∶10的样品匀液。
图3－36 菌落总数测定流程图
（2）检样为碳酸饮料。
先用75%酒精棉擦拭瓶口消毒，以无菌操作开盖，将检样倒入500mL灭菌磨口瓶内，口勿盖紧，其上覆盖一层灭菌纱布，轻轻振摇，待CO2气体全部逸出后，用灭菌吸管吸取检样25mL，放入500mL烧杯中，加入灭菌生理盐水225mL，用灭菌玻璃棒充分搅拌，使溶解均匀，得1∶10稀释液。或以无菌吸管吸取25mL检样置盛有225mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1∶10的样品匀液。
注意：对酸性饮料，需用10%灭菌Na2CO3调节其pH至中性，再进行检验。
2．菌落总数测定
（1）检样稀释。
无菌操作，将灭菌生理盐水分装于2支灭菌试管中，每支9mL，然后取1mL 1∶10（即10－1）稀释液注入第1管9mL无菌生理盐水中，摇匀，得到10－2稀释液，再自第1管取1mL 10－2稀释液注入下一管无菌生理盐水中，摇匀，得到10－3稀释液。每递增稀释一次，即换用1支1mL灭菌吸管。
（2）加样。
自10－1、10－2、10－3三个稀释度的试管中各取1mL稀释液加入空的灭菌培养皿中，另吸取灭菌生理盐水1mL加入空的灭菌培养皿中，同时做空白对照。每个稀释度和空白对照做两个培养皿。
（3）倒培养基。
各倾注约15mL已熔化并冷却到45℃左右的平板计数琼脂培养基，立即在桌上做平面旋摇，使样液与培养基充分混匀。
（4）培养。
待培养基凝固后，倒置于（36±1）℃培养箱中培养，对块状食品和粉状食品培养时间为（48±2）h，对液态食品培养时间为（24±2）h，进行菌落计数。
用菌落计数器计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得1g（mL）食品所含菌落总数。
菌落总数测定流程图如图3－36所示。
3．大肠菌群测定
（1）检样稀释。
同菌落总数测定的检样稀释，得到10－1、10－2、10－3三个稀释度的均匀稀释液。
（2）初发酵试验。
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），分别接种于月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤，每个稀释度接种3支平行管，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤）。置（36±1）℃培养箱中培养（24±2）h，观察倒管内是否有气泡产生，（24±2）h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至（48±2）h，产气者进行复发酵试验。未产气者报告大肠菌群阴性。
（3）复发酵试验。
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤管中，（36±1）℃培养（48±2）h，观察产气情况。产气者，记录为大肠菌群阳性管。
（4）大肠菌群最可能数的报告。
按确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（表3－31），报告1g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。
表3－31 大肠菌群最可能数（MPN）检索表
续表
注1：本表采用0．1g（mL）、0．01g（mL）和0．001g（mL）三个稀释度，每个稀释度接种3管。
注2：表内所列检样量如改用1g（mL）、0．1g（mL）和0．01g（mL）时，表内数字应相应除以10；如改用0．01g（mL）、0．001g（mL）、0．0001g（mL）时，则表内数字应相应乘以10，其余类推。
大肠菌群测定流程图如图3－37所示：
图3－37 大肠菌群测定流程图
五、结果记录
食品检样：______批号：______生产厂家：______
请列表记录原始数据并报告所测食品的菌落总数和大肠菌群的最可能数。
（1）食品的菌落总数（表3－32）。
表3－32 所测食品的菌落总数
（2）食品的大肠菌群数（表3－33）。
阳性结果记“＋”，阴性结果记“－”。
表3－33 所测食品的大肠菌群最可能数
（3）结论：所检测食品是否达到国家规定的食品卫生标准？
六、思考题
（1）食品检验为什么要测定菌落总数和大肠菌群数？
（2）食品中大肠菌群检验为什么首先要用LST肉汤管进行初发酵？为什么要经过复发酵才能证实？复发酵时为什么使用BGLB肉汤管需加胆盐？
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