实训42 噬菌体的分离与纯化
一、实训目的
（1）学习并掌握分离、纯化噬菌体的基本原理和方法。
（2）观察噬菌斑。
二、实训原理
噬菌体即细菌的病毒，它在自然界分布很广，凡是有宿主细胞存在的地方，一般都能找到相应的噬菌体。如在人粪及下水道污水中能找到肠道细菌的噬菌体，在发酵工厂排出的废弃发酵液中能找到裂解发酵菌株的噬菌体，在土壤中可以分离到许多土壤微生物的噬菌体，在发生严重危害期间，甚至从空气中也能分离到噬菌体。在苏云金杆菌粉生产车间和干酪生产中，几乎到处都能分离到噬菌体。
噬菌体对宿主有高度的特异性，可以其宿主作为敏感菌株进行噬菌体的培养与分离。噬菌体对生长在固体培养基上的宿主细胞在裂解过程中能形成肉眼可见的空斑，即噬菌斑。一种菌体可能是若干种噬菌体的宿主，不同的噬菌体所产生的噬菌斑在形态大小方面各不相同，所以必须进行纯化。由于一个噬菌体只产生一个噬菌斑，故可根据噬菌斑的数目推算出每毫升培养液中活噬菌体的数量，即噬菌体的效价。
三、实训器材
1．菌种
苏云金杆菌天门变种7216。
2．培养基
上层肉汤蛋白胨琼脂培养基（含琼脂0．6%，每试管装4mL），底层肉汤蛋白胨琼脂培养基（含琼脂1．5%～2%），肉汤蛋白胨培养液。
3．其他
无菌吸管，无菌培养皿，无菌抽滤瓶，无菌玻璃刮棒，锥形瓶，恒温水浴箱，真空泵，废弃发酵液。
四、实训步骤
1．分离
（1）制备菌悬液：取苏云金杆菌天门变种7216斜面菌种一支，加无菌水4mL，洗下菌苔，制成菌悬液。
（2）增殖噬菌体：在100mL的肉汤蛋白胨培养液中加入苏云金杆菌天门变种7216菌悬液2mL及0．2mL的噬菌体发酵液，于32℃培养10～16h。
（3）制备噬菌体裂解液：将上述增殖液离心15min（2500r／min），取上清液用细菌过滤器过滤，并将滤液倒入另一无菌锥形瓶中置于37℃培养过液，以作无菌检查。
（4）验证噬菌体的存在：上述滤液若无菌生长，可进行有无噬菌体存在的试验，其方法有试管法和琼脂平板法两种，本试验按琼脂平板法进行。
①于肉汤琼脂平板上滴加苏云金杆菌天门变种7216菌悬液一滴，用无菌玻璃刮棒涂布成一薄层。
②待平板上菌液干燥后，滴加上述滤液一小滴或数小滴于平板上，另做一个滴加无菌水的平板作为对照。然后倒置于32℃培养24h，若滤液中噬菌体存在，即可看到滴加滤液处无菌生长，且呈蚕食状的空斑。
③如果证明有噬菌体存在，可再将滤液接种于苏云金杆菌的肉汤蛋白胨培养液内，如此重复移种数次，即可使噬菌体增多。
2．纯化
最初分离出来的噬菌体往往不纯，如表现在噬菌体的形态、大小不一致等，所以需要进行噬菌体的纯化。
（1）将含有苏云金杆菌天门变种7216的噬菌体的滤液，用肉汤蛋白胨培养液按10倍稀释法进行稀释，使成10－1、10－2、10－3、10－4、10－5等5个稀释度。
（2）倒底层平板：用9cm直径的培养皿5个，每个皿约倒10mL底层琼脂培养基，依次标明10－1、10－2、10－3、10－4、10－5。
（3）倒上层平板：取5支装有4mL上层琼脂培养基的试管，依次标明10－1、10－2、10－3、10－4、10－5。熔化后放在50℃左右的水浴箱内保温，然后分别向每个试管加0．1 mL苏云金杆菌菌液，对号加入0．1mL各稀释度的滤液，摇匀，然后倒入底层琼脂已凝的培养皿中摇匀。
（4）待上层琼脂凝固后，置于37℃培养18～24h。
（5）检查平板上的噬菌斑，若噬菌斑大小、形态不一致，用接种针在选定的噬菌斑上刺一下，接种于含苏云金杆菌天门变种7216的肉汤蛋白胨培养液中32℃培养24h，再按上述方法进行重复操作，直至平板上出现的噬菌斑在形态、大小方面一致，则表明已获得纯的噬菌体。
五、思考题
噬菌体与细菌在分离、纯化的基本原理和具体方法上有何异同？
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