仪器分析技术在植物化学成分结构研究中的应用

仪器分析技术在植物化学成分结构研究中的应用_中国灭鼠植物及其

二、仪器分析技术在植物化学成分结构研究中的应用

（一）质谱（massspectrometry，MS）

近30年来，质谱技术只在有机化合物小分子的结构测定中发挥了重要作用，而对于大分子（相对分子质量超过1000）、极性分子和难挥发的分子，则显得无能为力。20世纪70年代以来，由于开发了使样品不必加热汽化而直接电离的新技术新方法，如化学电离质谱（chemicalionizationMS，CI-MS）、场解析电离质谱（fielddesorptionionizationMS，FD-MS）、快原子轰击电离质谱（fastatombombardmentMS，FAB-MS）、基质辅助激光解析电离质谱（matrix-assistedlaserdesorptionionizationMS，MALDI-MS）及电喷雾电离质谱（electro-sprayionizationMS，ESI-MS）及串联质谱（MS／MS）等，使得质谱比较有效地用于糖苷、蛋白质、多肽、糖肽及核酸、多糖结构和顺序的测定。

质谱测定有机分子的分子量，是目前最快速和准确的方法。正确的判断分子离子峰，即根据质谱图求出分子的分子量，是结构测定和解析质谱图的第一个重要步骤。测定分子离子峰应当注意：

（1）测定的分子量应当遵循有机分子的偶数和奇数规律。

（2）正确地识别各种同位素峰，并把它们与分子离子峰区别开来。

（3）有些分子的分子离子峰很低或不存在，例如醇类。

（4）样品应当纯化。

高分辨质谱仪不但能测定分子量，尚可以测定分子式。原子精确的原子量，例如：

H¹1.007825；C¹²12.000000；N¹⁴14.003074；O¹⁶15.994914。

分子量整数位相同的分子可以由不同的元素组成，它的精确的分子量却不相同，例如：

C₄H₈O　　　　 72.057511

C₂H₄N₂O　　　72.032360

C₃H₄O₂　　　 72.021127

C₃H₆NO　　　 72.045107

C₃H₈N₂　　　 72.068745

C₅H₁₂　　　 　72.093896

用高分辨的质谱仪将分子的m／z测到小数点后第三位，就很容易判断该分子的分子式。例如测定的m／z为72.069，则分子式应为C3H8N2。

也可以利用同位素峰与分子离子峰的丰度比来测定分子式。例如分子量为72的上述六种分子，由于它们的C、H、O、N的组成不一样，同位素的丰度和分子离子峰的丰度比不同，见表2-2。

表2-2　分子离子峰与同位素峰的丰度比

若测量的分子的M＋1为4.15，M＋2为0.30，则可判断分子式为C₃H₆NO。当然利用同位素峰测定分子式的准确度没有高分辨质谱仪测定的准确，但可以作为一个很有价值的参考。相同分子量不同组分的化合物的同位素丰度比，可参阅有关书籍。

质谱另外一个主要的应用就是解析结构。质谱是以质量为单位构成的谱带，不同质量的碎片由不同的元素组成，结合碎片的相对丰度可以考虑它们的稳定性和断裂难易，推测各个碎片互相联系的方式。而且其碎片化多具有极好的规律性即重现性，所以，可以从积累的各类结构裂解方式中，找出一些裂解规律强、特征明显的碎片离子，来解析化合物的结构。

1.电子轰击电离质谱（electronimpactionizationMS，EI-MS）

电子轰击电离质谱又称电子电离质谱。它是应用最普遍、发展最成熟的方法。测定EI-MS时，需要先将样品加热汽化，一般采用70eV能量的电子轰击样品而发生电离。所以相对分子质量较大、热不稳定、难于汽化的化合物，如一些较强的极性分子（如糖苷、羧酸、氨基酸）以及一些生物大分之（如多糖、肽类、蛋白质等），往往测不到分子离子峰，只能得到碎片峰。因此，一般将对热不稳定的样品，进行甲基化、乙酰化或三甲基硅醚化，制备成热稳定性好的挥发性衍生物后再进行测定。

电子电离的缺点为当样品分子稳定性不高时，分于离子峰的强度低，甚至没有分子离子峰。当样品分子不能汽化或受热分解时，则更没有分子离子峰。

电子电离方法有易于实现、所得质谱图再现性好以及含有较多的碎片离子信息等优点，这对于推测未知物结构是非常必要的。

2.场解析电离质谱（FD-MS）

FD-MS系1969年H.D.Beckey所发明，将样品涂于布满微针的钨丝发射极上，在强电场作用下，样品分子不经加热汽化电离而形成准分子离子（quasi-vmolecularion）和少数的主要碎片离子，所以FD-MS特别适合于单热不稳定、极性强、难挥发的样品，检出灵敏度高，可达10～11g。

FD-MS常给出3个准分子离子峰：［M＋H］＋、［M＋Na］＋（丰度最大）、［M＋K］＋，但碎片离子峰少。糖苷类常可见到由于苷键的裂解从［M＋H］＋或［M＋Na］＋依次产生脱去糖基的碎片，同样，FD-MS谱可给出肽类按酰胺键裂解依次产生脱去氨基酸残基的碎片。

FD-MS对测定上述类型化合物的相对分子质量以及确定糖链或肽链中糖及氨基酸残基的顺序有重要帮助。

3.快原子轰击质谱（FAB-MS）

FAB-MS是1981年M.Barber开发的一种快原子轰击软电离技术。其原理为，一束高能中性原子如氩、氙，撞击存在于液态基质中的样品分子，使样品离子化。这样可以得到提供相对分子质量信息的准分子离子峰相和主要结构信息的碎片峰，并能得到正离子和负离子谱。样品调在低挥发性的基质如m—硝基苄醇（m-nitrobenzylalcohol，mNBA）、聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）及甘油（glycerol）等中。

FAB-MS绐出的准分子离子峰的组成较复杂，除质子转移之外尚可能加合基质分子及金属离子。由FAB-MS所得质谱也有碎片离子峰，因而也提供了结构信息。此外，基质分子也会产生相应的峰，如甘油会有m／z93、185及277等。有时出现倍分子离子峰如［2M］—、［2M－H］—及［3M-H］—。

碎片类型与FD-MS基本相同。FAB-MS还可给出相应的阴离子质谱，与阳离子质谱互相补充，大大增加了信息来源及可信程度。FD-MS在高质量区提供的信息比较详尽，但苷元部分的结构碎片信息则相对较少，而FAB-MS则不然，除了给出相对分子质量及糖的碎片信息外，在低质量区还出现苷元的结构碎片，从而弥补了FD-MS的不足。

如果［M＋H］＋或［M－H］—尚未能确认，此时可在样品中加入碱金属盐，主要产生准分子离子［M＋Li］＋、［M＋Na］＋、［M＋K］＋，由此可确认相对分子质量及分子式。正离子FAB－MS中，这种阴离子加合离子通常表现为较高的强度，而很难找到碎片与碱金属的加合离子。采用FAB-MS法利用各裂解碎片的强度直接确定寡糖中苷键的连接位置，为皂苷化学结构研究提供了新的简便方法。

近年来，用快原子轰击质谱直接测定皂苷分子的分子离子已很普遍。一般分子离子峰［M＋］很弱，而［M＋H］＋较强。裂解多发生在各苷键位置，从而产生一系列糖基碎片及分子减去相应糖基后的碎片，这些碎片对确定各糖的连接顺序极为有用。

4.电喷雾电离质谱（ESI-MS）

电喷雾电离质谱适用于极性和热不稳定化合物甚至混合物的分析，为研究天然产物提供了一种简捷、快速、灵敏的分析方法。1985年，Fenn等人首先报道了大气压电喷雾（ESI）质谱系统，其电喷雾的过程如下：（1）喷雾器顶端施加一个电场给微滴提供静电荷；（2）在高电场下，微滴表面产生高的电应力，使表面被破坏产生微滴；（3）荷电微滴中溶剂的蒸发；（4）微滴表面的离子“蒸发”到气相中，进入质谱仪。FAB-MS可以显示碎片离子，但只能产生单电荷离子，因此不适用于分析相对分子质量超过分析器质量范围的分子。ESI-MS可以产生多电荷离子，每一个都有准确的小m／z值，还可以产生多电荷母离子的子离子，这样就可以产生比单电荷离子的子离子更多的结构信息。此外，ESI-MS可以补充或增强由FAB获得的信息，即使是小分子也是如此。那些因没有分子离子或只有nmol量级而不能用FAB检测的大分子寡糖，即使样品只有pmol量级且未经衍生，也可以使用ESI-MS分析。因此，ESI-MS成为当前分析大分子糖及复合物的最好方法之一。

电喷雾多极串联质谱（tandemmassspectrometry，ESI-MSn，n为串联级数）不仅能监测分离过程，直接对粗分物中的已知成分快速表征，还可以对样品中的未知化合物进行结构预测，从而简化分离、纯化及结构鉴定的过程。

（二）红外光谱（infraredspdctroscopy，IR）

1.基本原理

分子吸收红外线，使分子中的振动能量增大。分子中的振动能也是量子化的，它对红外线的吸收同样具有选择性，物质对红外线的选择性的吸收构成红外吸收光谱，也叫振动光谱，由于振动能级的跃迁常伴随着一些转动能级的改变，所以振动光谱也是具有波形的吸收带而不是线型，但比紫外可见光区的吸收光谱精细得多。对一般有机化合物的分析研究工作，红外吸收光谱的波长范围常用的是2.5～25μm（4000～400cm－1）的一段。如图2-7为氧化苦参碱的IR图谱。

图2-7　氧化苦参碱的IR图谱

2.有机化合物对红外线的吸收特点

表示分子中某一特征吸收频率强度的ε，在红外光谱文献中，有时写具体数值，有时不写具体数值，而用强（S），中（m），弱（w）来表示。红外线的吸收与分子结构有密切关系，有机化合物各有其自身的特征吸收光谱。在可见及紫外光区产生吸收峰的物质在红外光区也产生吸收峰；在可见及紫外区不产生吸收峰的物质在红外区也产生吸收峰。

一个有机化合物的红外吸收峰，一般是很多的，习惯上4000～1250cm－1区间称为特征频率区，在这个区域内很多吸收峰表示特征官能团的伸缩频率，这些吸收频率不高受整个分子结构环境的影响，亦即同一个官能团在不同的化合物中出现时，它们在这个区域内的吸收频率变化不大。例如，在－CH₂OH、＝CHOH和≡C—OH三种结构的醇类中，O—H健的伸缩振动频率均在3500～3300cm^－1。因此这个光谱区域内的特征峰对官能团的鉴定十分重要。但多数情况一个官能团有数种振动形式，例如—CH＝CH₂基团就有＝CH₂、C＝C两种弯曲振动所产生的四个特征峰。这一组特征峰是因—CH＝CH₂基团存在相互依存的吸收峰，这些峰可互称为相关峰，以区别于非依存的其他特征峰。

从1250～650cm－1之间的低频区称为指纹区，这些区域主要是各种单键的伸缩振动，以及多数基团的弯曲振动，除一部分ε值强的能加以解释外，很多是难以说明的，每一个化合物在这一区域内都有自己的特有的光谱，犹如人的指纹，没有两个指纹完全相同，所以称为指纹区。该区的光谱对于核对两个化合物是否相同非常重要。如再将4000～1250cm^－1的吸收峰与指纹区有关的吸收峰联系起来，便更可肯定某些基团的存在。

3.对红外吸收光谱的分析

根据有机化合物IR的特征频率，对IR图谱作出初步判断。有机化合物IR的特征频率如下：

（1）3600～2500cm^－1区。此区域的吸收峰表明存在含氢原子的官能团，其中—OH（3600～3200cm^－1）为强宽吸收峰，－COOH中—OH（3600～3200cm^－1）为宽散峰，—NH2（3500～3300cm^－1）为中等强度的双峰，而HN＜为单峰。

炔氢出现在3300cm^－1附近，而烯氢、芳氢及小环氢则出现在3100～3000cm－1附近。若在3000cm^－1以上有C—H吸收峰，表明为不饱和碳上的氢；若在3000cm－1以上无吸收，则为饱和碳上的氢。

甲基和亚甲基吸收在2950～2850cm^－1区，而1455cm^－1处吸收带的出现可进一步证实它们的存在；1390～1350cm－1区域吸收带是甲基的特征峰，如果它不存在，则表明可能是脂环（或开链两端有取代基）不含甲基支链。如1385cm－1附近出现双峰表明是偕二甲基［—CH（CH₃）₂］。

（2）2500～2000cm－1区。表明—C≡C—、—C≡N—存在，一般是中等强度或弱峰。

（3）2000～1333cm－1区。表明含有双键、酸酐、酰卤、酯、醛、酮、羧酸、酰胺、醌中的vC＝O吸收峰由高到低依次出现在1870～1600cm－1区，均为强峰。此外，—C＝C—、—C＝N—、—N＝O—在此区域有吸收，但—般在1650cm－1以下。苯环的两个特征峰在～1 600cm^－1和～1500cm^－1，可作为核实苯环的标志。在1650～1550cm^－1区有vN—H峰。

（4）1360～900cm^－1区。包括vC—O强吸收（1300～1000cm^－1）和vC—N强峰（1360～1180cm^－1）。

如果在上述某一区域中，没有吸收带，则表示没有相应的基团或结构，如果有吸收带，则按照下列次序作进一步研究。

（1）在3750～3000cm^－1之间有吸收带，可能存在着O—H和N—H伸缩振动；自由OH（无氢键的）的伸缩振动范围在3700～3500cm^－1，苯酚的自由OH吸收频率较低，约为3500cm－1；自由OH的吸收强度比生成氢键的为低，且只有在稀溶液中才能显出。有氢键的OH，吸收范围在3450～3200cm－1之间，显出较宽和较强的吸收带。

不成氢键的胺类吸收带在3500～3300cm－1范围内，而生成氢键的胺类则在3500～3100cm^－1范围内。这些吸收带较OH吸收带强度低，但比较尖峭。伯胺出现二个吸收带，仲胺一个，叔胺无。酰胺和内酰胺的N—H吸收带也在3500～3300cm－1之间。固态的羧酸甚至在稀溶液中都以双聚体存在，因此并不在上述范围内显出吸收带，但强而宽的吸收带出现在3000～2500cm^－1之间。

（2）不同类型的C—H键，分别具有一定的伸缩吸收区域，表2-3是一些主要C—H吸收带的大致位置。

表2-3　主要C—H吸收带

从表中可以看出，C＝C—H和Ar—H都超过了3000cm^－1，而脂肪族及醛类的C—H均低于3000cm^－1。此外应注意—CH3和—CH2—都出现两个吸收带。

（3）叁键的对称伸缩振动吸收范围见表2-4。共轭作用能使吸收波数略为降低，例如芳香腈类的C≡N吸收范围为2240～2190cm^－1。而对称的烯类和炔类没有相应的C＝C及C≡C吸收，是由于对称振动不能改变偶极矩短之故。

表2-4　叁键的吸收范围

（4）很多重要的图谱出现在碳基伸缩振动的区域内，见表2-5。

表2-5　羰基（C＝C）伸缩震动范围

共轭效应可使吸收带移向较小波数。而内酯的张力却提高了吸收的频率。

双键的对称性振动吸收与结构的关系，在1680～1600cm^－1范围内：＞C＝C＜，1680～1620；＞C＝N—，1690～1640；—N＝N—，1630～1575。假使含＞C＝C＜结构的化合物所带基因很类似，降低其极性，则吸收强度可降至极低。

芳香系统可在1650～1430cm^－1波段内出现一个或几个中、强的吸收带。

（5）在1000～650cm－1范围中的一些C—H弯曲振动，见表2-6及表2-7。这些吸收峰对辨识烯类和芳香环的替代情况较为有用。

表2-6　烯类C—H弯曲振动

表2-7　替代苯类的弯曲振动

4.光谱解析程序

在进行光谱解析时，应按照由简到繁的顺序。一般将光谱按特征区及指纹区划分为两个区域。

特征区：

（1）估计化合物具有哪些官能团。第一强峰有时可估计化合物的类别。

（2）确定化合物是芳香族、脂肪族饱和或不饱和化合物，主要由碳氢振动类型和是否存在芳环的骨架振动来判别：①碳氢振动类型v（CH）发生在3300～2800cm^－1之间，大体以3000cm^－1为界，v（CH）高于3000cm^－1时，则连接氢的碳原子是不饱和的；低于3000cm^－1，则碳原子是饱和的。②芳环的骨架振动v（CH）以取代苯为例（吡啶环、喹啉环及萘环与苯环类似），苯环的骨架振动出现在1650～1430cm^－1，非共轭环出现二个吸收峰，共轭环出现3～4个吸收峰，以1600±20cm^－1及1500±25cm^－1为主。这两个峰是鉴别有无芳环存在的标志之一。当芳环与取代基共轭时往往在～1580cm^－1处会出现第三个吸收峰，同时使～1500cm^－1及1600cm^－1峰加强，虽然在～1450cm^－1处有时还出现第四个吸收峰，但常与甲基的δas（CH）峰和次甲基的δ（CH）峰相重叠。

芳环的存在不能单由骨架振动决定，需由主要相关峰决定。

指纹区：

（1）作为化合物含有什么基团的旁证。指纹区的许多吸收峰都是特征区吸收峰的相关峰。

（2）确定化合物较细微的结构。如判别芳环上的取代基的几何异构体等。

解析光谱时，应先识别特征区的第一强峰的起源（由何种振动引起）及其可能的归属（属于什么基团），而后找出该基团所有或主要相关峰，以确定第一强峰的归属。依次再解析特征区的第二强峰及其相关峰。以此类推。必要时再解析指纹区的第一、第二、……强峰及其相关峰。采取“抓住”一个峰，解析一组相关峰的方法。较简单的图谱，一般解析三、四组相关峰即可解析完毕。但结果的最终判定，常需再对照标准光谱。

（三）紫外可见吸收光谱（ultraviolet－visiblespectra，UV-vis）

紫外可见吸收光谱决定于分子中价电子的跃迁，由于分子结构不同，电子所需的激发能就有差异，因而，不同的化合物表现不同的紫外吸收光谱。一般说来，185或200到400nm这一段，称为近紫外光，而小于上述波长的紫外光，因能被空气中的氧所吸收，只能在真空中进行工作，因此又称为真空紫外光。在实际工作中不常用。从400到800nm，就是可见光区。一般的紫外分光光度计，是包括可见光在内的，光谱范围在185～1000 nm或200～1000nm。到目前为止，一般的紫外分光光度计主要对具有共轭双键结构的化合物和芳香族化合物才能给出光谱，故可用紫外吸收光谱来鉴定这类化合物。

1.外层电子的跃迁类型

由原子的价电子相互作用生成σ键和π键，都能放出大量能量，因此稳定分子中的各个原子的价电子，都分布在σ轨道和π轨道中运动。而电子如果要进入相应的反键轨道σ轨道和π轨道，则需要提高很多能量，所以在一般情况下，反键轨道σ和π都是空的。此外，生成σ键一般比生成π键放出能量多，而σ轨道中的电子如果跃迁到σ轨道中去，所需能量也比π轨道中的电子跃迁到π轨道中去大得多。有些原子如氮、氧、卤族等，它们的外层电子只有一部分参加σ键和π键的生成，而有一对到三对电子在原来原子中的轨道中运动，称为孤电子对或P电子对，它们的运动轨道，称为非键轨道，以“n轨道”来表示。这些未参加化合键的P电子，在形成分子后，它们的能量基本上保持原有的能级。在分子中也可能被激发到σ或π轨道上去。

在饱和碳氢化合物中，C—C和C—H结构都是只含σ键的，没有π键或孤电子对，电子跃迁到反键轨道属σ→σ跃迁，它需要的能量很高，吸收远紫外区的能量。如甲烷，吸收峰在125nm。饱和烃的最大吸收峰常小于150nm，紫外无吸收，—般仪器不能观察到。

烯类中的C＝C双键上的π电子，吸收能量后，跃迁到π上，形成π→π跃迁，所吸收的能量较σ→σ跃迁小，吸收峰大都处于近紫外区，在200nm左右，吸收系数很大，大部分在五千到几十万之间，属于强吸收，如乙烯H₂C＝CH₂的吸收峰为160nm，ε（克分之吸收系数）为10000。至于化合物中含有杂原子的双键基团如C＝O，C＝N等，在杂原子上有不成键的P（n）电子对，吸收能量后跃迁到π轨道，形成n→π跃迁。这种跃迁所需的能量较小，近紫外区的光即可激发。其ε从十到几百。例如丙酮的吸收峰，除强吸收的π→π跃迁外（λmax194nm，ε为9000），还有吸收280nm左右n→π跃迁，ε为10～30。当在饱和化合物的分子上连有含杂原子的基团时，—OH、—NH2、卤素、—S等，杂原子上未共用的n电子跃迁到σ键上，形成n→σ跃迁，所需能量与π→π接近。如甲醇，除σ→σ跃迁的吸收峰外，其n→σ跃迁的吸收峰在183nm，ε为150，属于中强吸收。

由此可知，电子从成键轨道跃迁到反键轨道，一方面，需要很高的能量，另一方面，能阶的跃迁是量子化的，亦即只能吸收适合其能量的光子，才能在瞬时跃迁到反键轨道。

电子能阶的跃迁虽然是量子化的，但其光谱并非线状，因为当电子能阶跃迁时，总是伴随着各种可能的转动和振动能阶的跃迁，这样就在一定特定的光谱范围内，出现数量极多的吸收线或小吸收带，合并而成吸收带。因此，吸收图谱便成波形，且吸收带很宽，带与带之间的叠合现象很严重，往往波波相连，只露出不同的峰顶。

2.紫外吸收光谱与化学结构的关系

（1）几个常用名词的介绍：

①发色团：在光谱学中，某个基团、结构或系统，能在某一段光波范围内出现吸收带的，便称为这一段光波范围内的发色团（chromophore）。在紫外光谱中若有机化合物的分子结构中含有π键结构，能形成π→π或n→π跃迁的基团，如C＝C、—NO₂、C＝O、C≡C、共轭双键系统（包括芳香族化合物）等都称为发色团。

②助色团：助色团（auxochromes）是与发色团及饱和烃相连并能使其吸收峰向长波长移动的带有杂原子的饱和基团，如—OH、—NH₂及卤素等，这峰基团本身在紫外区内并无吸收，例如饱和烃本身只有σ→σ跃迁，若和助色团相连，产生n→σ跃迁，使吸收峰向长波长移动，同时往往还使吸收强度增加。

助色团与发色团相连产生n→σ跃迁，使吸收向长波长移动。以乙烯为例，它与助色团相连接时，—NR2（＋40nm），—OR（＋30nm），—SR（＋45nm），—Cl（＋5nm），—CH3（＋5nm），烷基也是一种助色团，但影响较小。助色团如果和共轭双键或苯环相连，同样也会使吸收向长波长移动，吸收强度增加，例如苯有一个吸收峰在255nm，ε为230，当它被一个—OH基取代后，吸收峰移至270nm，ε为1450。

（2）几种效应：凡是结构的变化（如顺式、反式等）、共轭系统的延长、加入助色团及其他一切原因（如溶剂变动和溶液的pH值变动等）使吸收峰向长波长移动的现象称为深色移动（bathochromicshift）或红移（redshift）；向短波长移动的现象称为浅色移动（hypsoch-romicshift）或紫（蓝）移（blueshift）。前者简称长移，后者简称短移。

吸收强度增加的现象称为浓色效应（hypsochromic）；吸收强度减少的现象称为淡色效应（hypochromic）。关于ε值，在紫外光谱中一般从10～100000，因此在画吸收曲线时，如果整个曲线各个吸收峰的ε值相差不多，吸收强度（纵坐标）可直接用ε值表示。如果相差很大就用logε表示，例如上述的一般吸收范围，logε＝1～5。

（3）吸收带：吸收带（absorptionband）就是吸收峰在紫外光谱中的波带位置，根据电子及分子轨道的种类，可将吸收带分为四种类型：R带、K带、B带和E带。一种化合物的光谱能显示四种吸收带的情况是很少的。解析有机分子的吸收带有助于推测化合物的分子结构。

①R带：R带相当于发色团及助色团形成P—π共轭基团的结构（如C＝O、—NO、—NO2、—N＝N—等）发生n→π跃迁时所吸收的能量。其特点是处于较长波带范围，而且ε＜100（logε＜2）。

②K带：K带相当于共轭双键中π→π跃迁所吸收的能量，吸收峰波长比R带短，ε＞104。例如丁二烯CH₂＝CH—CH＝CH₂的λmax为217nm（ε，104）。就属于π→π跃迁的K带。若共轭双键增加，不但产生长移，化合物由无色变为有色，而且吸收强度也随之增加。

③B带：相当于芳香族或芳杂环族化合物的特征吸收带，苯在230～270nm（ε约为230）的谱带上，出现苯的多重吸收带或称精细结构，是由于苯环的π→π跃迁引起的。在极性溶剂中测定时，B带常出现一宽峰，其重心在256nm附近，ε为220。B带的精细结构常用来辨识芳香族化合物，但苯环被取代后，这些小峰即行消失。当苯环和发色团联结时，有B和K两种吸收带，其中B带的波长较长。例如苯乙烯，在吸收光谱除出现λmax为244nm（ε，12000）的K带外，还有λmax为282nm（ε，450）的B带。在芳香族化合物的光谱上如有K、B及R带，则R带的波长最长。

④E带：E带也同B带一样，是芳香族化合物的特征吸收之一，系由苯环结构中环状共轭体系的三个乙烯键的跃迁所引起的，分为E1带及E2带两个区域。E1带的吸收峰在180nm（ε，47000）附近，E2带吸收峰在200nm（ε，7000）附近。E1是不能观察到的，E2可能因助色团或发色团的取代而产生长移，在200～230nm可能看到。

（4）溶剂效应：化合物在溶液中的紫外吸收光谱和它的气体光谱不同，在非极性溶剂如己烷中所得的光谱接近于气体。极性溶剂如水、醇、酯和酮对溶质的吸收带影响较大，这是因为溶剂和溶质间常形成氢键，或溶剂的偶极使溶质的极性增强，引起n→π及π→π吸收带的迁移。在π→π跃迁的情况中，激发态的极性比基态强，极性溶剂使激发态的能阶降低，π→π跃迁就容易；在n→π跃迁情况中，来共用电子在基态时与极性溶剂容易形成稳定的氢键，使跃迁不易，因此跃迁能量就增加。前者吸收长移，后者吸收短移。

3.吸收光谱与分子结构的关系

（1）分子结构：

①饱和有机化合物：如前所述，此类化合物只能产生σ→σ跃迁。紫外无吸收。如与助色团相连，除σ→σ跃迁外，还有n→σ跃迁，这种跃迁所产生的吸收峰小于200 nm波长，有时与σ→σ跃迁的峰相合并。当饱和烃为杂原子如氧、氮、卤素等取代后，由于这类原子具有不成键的电子，它不但使原有的σ→σ跃迁能量减少，向长波移动，而且还产生了n→σ跃迁。例如CH3I的σ→σ跃迁其λmax为210～150nm，所产生的n→σ跃迁其λmax为259nm。

②不饱和脂肪族化合物：孤立双键的烯烃产生π→π跃迁的吸收峰在近紫外区，具共轭双键的烯烃其π→π跃迁的吸收峰，则移向长波，吸收强度也增加，甚至化合物由无色变为有色。除了碳－碳双键共轭外，其他共轭系统，如C＝C—C≡CH、C＝C—C＝O、O＝C＝C—C＝O、C≡C—COOH等也发生同样的效应。有些共轭烯烃，其λmax值与结构的关系已可由经验规律算出（这些规律有时可称为WoodwardandFieser’srule）。如果一个化合物具有几个可能的共轭双键结构，只要将可能的各个结构的最高吸收峰算出，再用紫外分光光度计实测，与计算值核对后，便可确定是那一个结构。

（2）吸收光谱：

①芳香族化合物的吸收光谱：

苯：苯在180～184nm（ε，4700）和200～204nm（ε，7000）有E1带及E2带，在230～270nm还有较弱的一系列的精细结构吸收带（B带）。

取代苯：苯环上引入取代基都有长移现象，吸收强度也增大。现将单取代苯的取代基分为三类：

一类为烷基和卤素等，它们对苯环的影响主要是诱导效应，这些基团对基态和激发态的能量的影响不大，所以吸收峰波长的移动亦不大，略向长波移动，同时吸收增强。

另一类为氨基、羟基、氧烷基等，这类取代基有不成键的孤电子对，能与苯环产生p－π共轭。这类取代基对光谱的影响较大，使吸收带长移，吸收强度增大。例如苯胺的K带和B带相应为λmax230nm和280nm（水为溶剂），但和盐酸成盐后，由于孤电子对被占用，p－π共轭消失，取代基的影响也相应减弱，因此它的吸收光谱与苯相似。

还有一类为不饱和取代基，如－C＝CH2、－CHO、－NO2等，这类取代基对苯环的影响和它对多烯化合物中增加共轭有相似的效应，使吸收强度和波长大大增加。但若双键和苯环中间有亚甲基，则化合物的光谱是烷基取代苯和双键的和。

②杂环芳香族化合物：苯环的－CH＝为－N＝苯取代，或环戊二烯的＞CH2－为＞NH、－S－，或－O－取代后，虽使吸收增强，但对波长的影响较小，其中只有含氮化合物，向长波移动较大。杂环芳香族化合物若有助色团或发色团取代，吸收带常向长移，吸收强度也有增强。

（3）紫外吸收光谱的应用：

①物质的鉴定：紫外光谱应用于有机物的鉴定工作。在鉴定时，试样和标准品以相同浓度配制在相同的溶剂中，分别测定吸收光谱，比较光谱是否一致。如无标准品，也可以和现成的标准图谱相比较。如果一个有机化合物在紫外可见区是透明的，则很可能是脂肪族碳氢化合物、胺、腈、醇、羧酸、氯代烃和氟代烃，也可能不含双键或环状共轭体系，没有醛、酮或溴碘等基团。但是紫外光谱仅是发色团与助色团的反映，并非整个分子的特征。不同的物质可能具有相同的发色团，因而具有相同吸收光谱的物质并不意味着是相同的化合物。

②纯度的检查：分光光度计的灵敏度很高，微量物质亦能表现出吸收光谱，因而可利用它进行其他化学或物理方法不能进行的纯度检查。例如乙醇中苯的检查。只要观察240～260nm的光谱就可知道，乙醇在此波段无吸收，而苯在255nm处有一吸收峰。

③有机物分子结构的研究：物质的吸收光谱是由于分子中的某些发色团所致，若对未知结构的化合物的吸收光谱作详细的分析，则可从吸收光谱推测某些发色团是否存在，从而了解其分子结构。

④立体结构的确定：化合物的顺式与反式中双键的能量是不一致的，其吸收光谱亦不同。共轭系统中，电子的传递需要在同一平面，否则共轭效应受到阻碍，顺式常易脱离平面而使长移减弱，故其激活能就要提高，λmax变小，即空间阻碍。

⑤应用于定量分析：按光的吸收定律，A＝εbc。溶液的吸收度与浓度成正比，因此，只要根据吸收光谱，选择一定波长的光为入射光，测定溶液的吸收度就可以求出溶液的浓度和物质的含量。

⑥植物化学成分的分析：植物所含化学成分原则上也可用紫外吸收光谱来进行分析鉴定，但因样品往往需要对其原材料或粗提物进行质量鉴定或含量测定。也就是说往往会遇到所研究的对象是未知成分或复杂的混合物，目前由于大多数植物的有效成分尚未弄清，在这种情况下，有时也只能探索某些方法，给予间接的、粗略的分析，由于吸收光谱的方法简单，特别是对于未知物成分和用化学方法很难分析的成分显得更为有用。

最后应当指出，紫外吸收光谱主要是反映化合物中所含共轭系统的情况，在推测分子的顺式或反式、酮式与醇式以及邻位、间位与对位的苯的衍生物，亦即在制定分子的骨架方面作用很大。但是单凭紫外吸收光谱是不能肯定一个未知物的结构的，必须与其他方法配合才行。

（四）核磁共振光谱（nuclearmagneticresonance，NMR）

原子核带有电荷，如有自旋现象即产生磁矩，其方向可由右手规则确定。如1H、13C、19F、31P等。它们的自旋量子数I为1／2。这类原子核能产生核磁共振光谱。在有机化学方面质子（1H）和13C的核磁共振光谱甚为有用。

把自旋量子数I＝1／2的质子放到磁场中后，有些1H的磁矩与磁场方向一致，用磁量子数m＝＋1／2表示；有些1H的磁矩方向相反，磁量子数m＝－1／2。磁量子数m＝－1／2的原子核，由于磁矩方向与磁场方向相反，因此它们的能量要比m＝＋1／2的原子核的能量高。

二者之间的能量差别与磁场强度成正比，即：ΔE＝hv＝2μH

式中H为外加磁场强度，μ为比例常数（即原子核的磁矩在磁场方向的分量），h为Plank常数，v为光子的频率。

在磁场中自旋的原子核如果吸收或放出相当于ΔE能量的光子才可以从一个能阶跳到另一个能阶。

如果处于两种能阶的核的数目相等，那么跃迁到高能阶（吸收无线电波的光子）和跌落到低能阶（发射无线电波的光子）的几率相等，见不到吸收或发射现象。

实际上当含质子的样品被置于某一定强度的磁场中，处于较低能阶的质子数（m＝＋1／2的质子）比处在高能阶的质子数（m＝－1／2的质子）仅多百万分之几。因此对入射光的吸收是很弱的。一般光学仪器无法测量，而要利用核磁共振现象才能测量出这种微弱的吸收。这样得到的光谱称为核磁共振光谱。

在有机化合物分子结构测定中，核磁共振图谱解析技术的重要性已毋庸赘言。它将提供分子中有关氢及碳原子的类型、数目、相互连接方式、周围化学环境、甚至空间排列等信息，是有机化合物结构测定中最重要的一种工具。近来，随着超导FT-NMR的问世，各种软件技术的开发应用日新月异，不断得到发展与完善，从而大大加快了结构研究工作的进度。目前，相对分子质量1000以下、几个毫克的微量物质甚至单用NMR测定技术也可确定它们的分子结构。因此，1HNMR及13CNMR的各种最新技术以及各种同核及异核二维NMR相关谱的解析技术，对进行植物化学成分结构的研究工作显得特别重要。

1.一维核磁共振谱（1DNMR）

（1）核磁共振氢谱（1HNMR）1HNMR测定中通过化学位移（δ）、积分曲线高度以及裂分情况（重峰数及耦合常数J）来判断分子中1H的类型、数目及相邻原子或原子团的情况，对有机化合物的结构测定有着重要意义。

①化学位移（chemicalshift，δ）：从理论上讲，1H在14092高斯的磁场中，将吸收60兆周的电磁波。但实验发现，化合物中各种不同的氢原子，所吸收的频率稍有不同，差异范围约为百万分之十。造成这种差别的原因，是由于氢原子核外围的电子在外加磁场的诱导下产生对抗磁场，与外加磁场的方向相反，亦即外围电子起到排斥磁力线的作用，使得氢原子核实际受到磁场的作用稍有降低。因此势必要提高磁场强度去抵消电子的排斥作用，才能发生共振，因而吸收信号就将出现在比原来外加磁场强度更高的位置。

外围电子对抗磁场的作用，称为屏蔽作用。它们这种对抗磁场的性质，叫做抗磁性。屏蔽作用的大小与核外围的电子密度有关。核外电子密度越大，屏蔽作用也就越强。磁场强度就要相应地增加，才能获得共振信号。核外电子密度与价键的电子密度、邻近基团的诱导效应，以及给电子还是拉电子共轭效应等密切相关。换言之，就是与原子核的化学环境有关。因此一个化合物中的氢原子，由于它们的化学环境不同，外围电子密度也就不可能相同，屏蔽作用也就有大、有小。它们出现共振信号的位置当然也就不一样。如图2-8所示，乙烷的屏蔽作用较强，如电磁波的照射频率不变，它需要的外加磁场强度最高。反之，如外加磁场强度不变，则它所需的照射频率将最低。由于频率差距很小，很难精确地测出它们的绝对值，于是采用一种标准品通常用屏蔽作用极强的四甲基硅（Me4Si，TMS）和样品放在一起测出核磁共振谱，以TMS的吸收峰为原点，其他各个氢核和原点之间的相对距离即为化学位移。相对数字较易测量，精确度可达1周／s以内。化学位移常以δppm（百万分之一）表示：

　　　　　　δppm＝［（v_样品－v_标准）／v_标准］×10⁶

　　　　　　式中v样品为样品吸收峰的频率；v标准为标准品吸收峰的频率。

化学位移δppm乘10⁶表示δ是ppm单位。由于v与H成正比，δ亦可用磁场强度H表示。TMS的屏蔽作用很高，吸收峰的位置在右边，一般化合物中氢的吸收峰都在它的左边，如以TMS的δ值作为零，则其他氢的δ值都为负值，文献中常将负号略去。

化学位移也可用τ值表示。以TMS的τ值为10，则其他的τ值大部分在0～10之间，也有在零以下的。δ值和τ值的关系如下：τppm＝10.00－δppm。

图2-8　各种不同氢原子的化学位移（60兆周）

图2－9列出了不同化学环境下氢的化学位移。

②峰面积：以积分曲线高度表示。1HNMR谱上积分曲线的总高度与分子中的总1H数相当，故如分子式已知，可据此算出每个信号所相当的1H数。

③信号的裂分及耦合常数（J）：已知磁不等同的两个或两组1H核在一定距离内会相互自旋偶合干扰而使信号发生裂分。表现为不同形状，如单峰（singlet，s）、二重峰（dou-blet，d）、三重峰（triplet，t）、四重峰（quartet，q）、多重峰（multiplet，m）等。

低级耦合中，裂分后的峰数n＋1，峰的面积（或强度）比以（a＋b）二项式展开后各项前的系数表示，其中n为干扰核的效目。裂分间的距离为耦合常数（couplingconstant，J，Hz），用以表示相互干扰的强度，并取决于间隔键的距离。间隔的键数越少，则J值越大；反之，则越小。通常，超过三根单键以上的耦合可以忽略不计。但在π系统中如烯丙基及芳环，因电子流动性较大，即使间隔超过了三根键，仍可发生耦合，但作用较弱。

一般相互耦合的两个或两组1H核信号耦合常数相等。故仔细测量并比较裂分间的距离对于判断1H核之间是否偶合相关很有用处。但用这种方法识别有多重耦合影响的1H核信号时十分困难。目前多采用同核去耦技术消除或部分消除相邻1H核的耦合影响，以利简化图谱，帮助识别。

（2）核磁共振碳谱（13CNMR）：在确定天然有机化合物结构时，与1HNMR相比，13C NMR的应用更为广泛和重要，但是由于NMR的测定灵敏度与磁旋比（γ）的三次方成正比，而13C的磁旋比因为仅为1H的1／4，加之13C的丰度比又只有1%，所以13CNMR测定的灵敏度只有1H的1／6000。近年来，由于脉冲傅里叶变换核磁共振（pulseFT-NMR）的出现及计算机的引入，才使这个问题得以真正解决。

随着脉冲扫描次数的增加及计算机的累加计算，13C信号将不断得到增强，噪声则越来越弱。经过成千上万次的扫描及累加计算，最后即可得到13CNMR图谱。

图2-9　不同化学环境下1H核磁共振信号的化学位移

13C的信号裂分：由于13C与1H均为磁性核，故在间隔一定键数范围内也可通过自旋耦合干扰，使对方信号产生裂分。1HNMR谱中，因为13C的自然丰度比较小，故这种耦合干扰影响极小，表现为微弱的“卫星峰”形式，埋在噪声之中，可以忽略不计。通常只需注意1H－1H之间的同核耦合影响。但13C谱则与上述情况不同，1H的耦合影响却表现得十分突出。因1H核自旋耦合干扰产生的裂分数目仍然遵守n＋1规律。以直接相连的1H的耦合影响为例，13C信号将分别表现为q（CH3）、t（CH2）、d（CH）及s（季碳），1JCH值约为120～250Hz。

实际上，除了1JCH影响外，由于还可能同时存在二根键（2JCH）及三根键（3JCH）的远程耦合影响，故13C信号还会进一步裂分，表现为更复杂的图形。为了搞清相互耦合的关系，可以进行各种形式的异核去耦试验得到不同类型13CNMR谱。综合分析这些图谱提供的结构信息，对于天然化合物的结构测定有着重要的意义。常见13CNMR谱类型有质子宽带去耦（protonbroadbanddecoupling）DEPT法（distortionlessenhancementbypolariza-tiontransfer）。

①质子宽带去耦：质子宽带去耦又称质子噪声去耦（protonnoisedecoupling），这是测定碳谱时最常用的去耦方式。其方法是采用宽频的电磁辐射照射样品使所有1H核饱和，从而全部消除1H－13C间的耦合，所有的13C信号在图谱上均以单峰出现，对判断13C信号的化学位移十分方便。又由于照射1H后产生NOE效应，除季碳峰出现软弱的峰以外，凡与1H核相连的13C信号强度都普遍增加。

②DEPT法：偏共振去耦谱中因为保留着1H的耦合影响，故13C信号的灵敏度将会降低；加以信号裂分之间可能重叠，也给信号识别带来一定困难。现在已被DEPT法取代。DEPT法系分别通过改变照射1H核的脉冲宽度（θ）或设定不同弛豫时间，使不同类型的13 C信号在谱图上呈单峰形式分别朝上或向下伸出，故灵敏度高，信号之间很少重叠。此法的优点为J值在一定范围内的变化对结果影响不大，且具有极化转移增强。目前已成为测定碳谱的一种常用方法。

13C信号的化学位移：13CNMR谱与1HNMR不同，化学位移的幅度较宽，约为200，故信号之间重叠很少，但别起来比较容易。与1HNMR一样，13CNMR的信号化学位移也取决于周围的化学环境及电子密度，并可据此判断13C的类型。改变某个13C核周围的化学环境或电子密度，如引入某个取代基，则该13C信号即可能发生位移。位移的方向（高场或低场）及幅度已经累积了一定经验规律。常见的如苯取代基位移、苷化位移、酰化位移等，在结构研究中均具有重要的意义。

常见化合物13CNMR的信号化学位移见图2-10。

2.二维核磁共振（2DNMR）

二维核磁共振谱（twodimensionalnuclearmagneticresonancespectroscopy，2DNMR）是在—维核磁共振谱基础上发展起来的新型实验方法，是有两个彼此独立时间域函数经两次傅里叶变换得到两个频率函数（W1和W2）的核磁共振谱，共振峰分布在两个频率轴组成的平面上，其最大特点是将化学位移、耦合常数等参数在二维平面上展开，于是在一维谱中重叠在一个频率坐标轴上的信号，被分散到由两个独立的频率轴构成的二维平面上，同时检测出共振核之间的相互作用。1DNMR由于方法本身的局限性，不能得到核磁共振所能得到的所有信息，在解决—些复杂结构方面仍显不足。若采用2DNMR技术可减少谱线的拥挤和重叠，提供核之间的相互关系的新信息，增加了结构信息，有利于复杂谱图的解析。

2DNMR技术中重要的化学位移相关谱（correlationspectroscopy，COSY），主要分为两大类：一类是同核化学位移相关谱（homonuclearchemicalshiftcorrelationspectroscopy），如1H－1HCOSY、1H－1HLRCOSY、全相关谱（totalcorrelationspectroscopy，TOCSY）和二维核奥氏效应（2DnuclearOverhauserspectroscopy，NOESY）谱等，是测定同核耦合的有力工具；另一类是异核化学位移相关谱（heteronuclearchemicalshiftcorrelationspectroscopy），如1H－13C COSY、HMQC（HETCOR）HMBC（COLOC和FLOCK）等，可以给出直接或远程异核耦合的关系，即得到碳氢之间的相互关系。

（1）同核化学位移相关谱：

①氢－氢相关谱（1H－1HCOSY）：这是二维化学位移谱的基础，是应用最广泛和最早的二维技术。氢－氢相关谱，系指同一自旋耦合体系中质子之间的耦合相关。通常，是从谱图中某已确定的质子（多从低场）信号分析入手，依次对其自旋系统中各质子的化学位移进行精确指定；同时、可依次找出其中耦合的各质子之间的关联（耦合氢片段），再结合碳氢耦合信息，从而可确定分子中各碳氢耦合片段，这是推导和确定结构的强有力工具。

图2-10　13C的信号化学位移

②远程氢—氢相关谱（1H－1HLRCOSY，1H－1HlongrangeCOSY）：在常规的COSY脉冲系列所测的COSY谱上，观察不到较小耦合的相关点，而远程1H－1H相关谱能大大增加来自远程耦合的相关点强度。LRCOSY谱与COSY共同比较分析，可确定三键和远程耦合相关信息。

③双量子滤波二维谱（DQF－COSY，doublequantumfiltercorrelation）：双量子相干滤波谱波层是COSY实验最重要的衍生系列之一。能得到直接耦合的，1H－1H耦合关系，它能压制对角线峰、水峰，滤掉过强的溶剂峰和单峰信号，适用于高场重叠严重的分子。

（2）异核化学位移相关谱：异核化学位移相关谱，即两种不同的核，如1H和13C以其拉摩（Larmor）频率通过耦合而相关，所得图谱称为二维异核位移相关谱。

①直接键合的13C－1H碳氢相关谱。常规的13C－1HCOSY谱（与1JCH相关）是指直接键连的碳氢之间的耦合相关，从一个已知的1H核信号，根据相关关系，可找到与之相连的13C的信号，对13C、1H信号的指定非常有效，是应用最广泛的二维技术之一。1H检测的异核多量子相干谱（HMQC，1Hdetectedheteronuclearmultiple-quantumcoherence）是近年开发的通过多量子相干间接检测低磁旋比核（如13C）的新技术。实际上，HMQC与常规1H－13CCOSY谱相似，只是一种高灵敏度的反向－键异核相关技术，用来测定分子中氢碳直接相连关系。由于多量子相干转移，使其灵敏度大大提高，与其他13C检测的二维技术相比，如异核二维相关谱（HETCOR，cross-correlatedheteronuclear），在测定时间相同的条件下所需样品量仅为其1／10～1／5左右，并且所提供的信息及谱图与常规1H－13CCOSY谱，完全相同。

②远程碳－氢相关谱（longrange13C－1HCOSY）：远程13C－1HCOSY谱（与2JCH、3JCH以上的13C－1H相关）是近些年来发展最快的二维技术之一。它能够提供两键（2J）及大于两键（3J）距离的碳氢耦合信号。对共轭体系以及有W形耦合的，可观测到4J耦合碳氢信号，建立C－C间的关联，甚至越过氧、氮或其他原子的官能团间的关联，成为推导结构、确定1H或取代基的立体取向以及季碳归属问题的强有力工具。由于该法能将季碳和相邻碳上的质子相关联，在确定分子结构中C－C的连接方面，其灵敏度比INADEQUATE法高得多，对结构解析有重要作用。异核多键相关谱（HMBC，heteronuclear multiplebondcoherence）是近些年开发出来的通过多量子相干间接检测低磁旋比核（如13 C）的一种高灵敏度的反向－键异核相关技术，用以测定氢碳直接相连关系。HMBC与COLOC和FLOCK谱相比，灵敏度更高，所需样品量仅为其1／5左右，即HMBC需样品量0.5～10mg。

（3）核奥氏效应（nuclearoverhausereffect，NOE）：由核的弛豫而产生的一种物理现象。当两个质子Ha和Hb在空间处于接近的位置时，用某种干扰场（F2）照射Ha使其饱和，则与之有交叉弛豫（偶极－偶极）作用的Hb信号增强的现象，称之为NOE效应。NOE效应在测定分子构型和取代基的立体构型以及结构解析中十分有用。

①二维核奥氏效应（2DNOEspectroscopy，NOESY）：NOESY谱即纵向弛豫，是NOE的二维谱方法，仍是表示质子的NOE关系。NOESY谱在一张谱图上同时呈现了分子中所有质子间的NOE信息，已成为研究有机化合物立体化学的有力工具。但在NOESY谱中确定信息仍有许多问题：距离较远的核间NOE交叉峰很弱；J耦合交叉峰的存在，给确定正确的NOE带来干扰；不能定量测定NOE。

②旋转坐标系奥氏增益谱（ROESY）：旋转坐标系奥氏增益谱（rotating-frameOver-hauserenhancementspectroscopy，ROESY）即横向弛豫，是—种灵敏的测定分子中NOE的二维谱方法。采用一个弱自旋磁场，则在旋转坐标系中产生交叉弛豫NOE，即得到旋转坐标系中的NOE增强谱—ROESY谱。因为ROESY是旋转坐标系的NOESY谱，虽然二者都能提供空间核自旋相关信息，但二者区别在于：NOESY是纵向交叉弛豫，而ROESY是横向交叉弛豫；NOESY谱更适用于小分子和大分子（如蛋白质等），中等分子（相对分子质量300～500）不易观测NOE；ROESY谱适宜于各种大小分子，可以检测较小的相互作用。