淀粉酶发酵制备技术

淀粉酶发酵制备技术_生物工艺学实验指

综合实验十一　淀粉酶发酵制备技术

一、背景知识

淀粉酶是具有水解淀粉和糖原能力酶类的统称，广泛存在于动植物和微生物中。淀粉酶可以将自然界中广泛存在的淀粉转化为单糖或低聚糖等可发酵性糖，是迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种之一。淀粉酶按照水解糖苷键方式的不同可以分为五大类。

（一）α-淀粉酶

α-淀粉酶全称为α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，又叫淀粉-1，4-糊精酶，液化酶是一种内切酶，从淀粉分子内部随机切割α-1，4-糖苷键，生成糊精和还原糖，从而使淀粉糊的黏度迅速下降，达到淀粉液化的作用，俗称液化酶。因产物的末端残基碳原子构型为α-构型，学名为α-淀粉酶。α-淀粉酶不能水解支链淀粉分支点的α-1，6-糖苷键，也不能水解α-1，6-糖苷键附近的α-1，4-糖苷键。微生物来源的α淀粉酶主要来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）、嗜热脂肪芽孢杆菌（B.stearothermophilus）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、黑曲霉（A.niger）等。细菌来源的α淀粉酶一般热稳定性比较好，最适作用pH一般为6.0～8.0中性范围。在工业上α-淀粉酶用途及其广泛，已经用于食品、发酵、谷物加工、纺织、造纸、医药、轻化工业、石油开采等各个领域，其中最大的用途是酶法生产葡萄糖、饴糖、棉布退浆、酒精发酵等。

（二）β-淀粉酶

β-淀粉酶又叫淀粉-1，4-麦芽糖苷酶，是一种外切型淀粉酶，从底物非还原性末端依次水解每间隔一个的α-1，4-糖苷键，终产物是麦芽糖。其酶制剂的来源曾经长期依赖于麦芽、甘薯和大豆。随着研究的进一步发展，目前已经开发了很多微生物生产菌种，主要有芽孢杆菌属的蜡状芽孢杆菌（B.cereus）、巨大芽孢杆菌（B.megaterium）、凝结芽孢杆菌（B.coaglans）、多黏芽孢杆菌（B.polymyxa）等。β淀粉酶主要用于淀粉糖的生产，如饴糖、高麦芽糖浆等。

（三）葡萄糖淀粉酶

葡萄糖淀粉酶又称糖化酶，是一种外切酶，水解方式是从淀粉或寡糖的非还原性末端开始，逐个切除葡萄糖分子。与β-淀粉酶相似，水解产生的游离半缩醛羟基发生转位作用，释放β-葡萄糖。它不仅能水解α-1，4-糖苷键，还能水解α-1，6-糖苷键和α-1，3-糖苷键，只是水解后两者的速度较前者要慢得多，因此葡萄糖淀粉酶作用于直链淀粉和支链淀粉时，其水解终产物全部为葡萄糖。许多微生物都可以产生葡萄糖淀粉酶，其中被研究较多的是真菌葡萄糖淀粉酶，工业上应用最多的是来自于黑曲霉（A.niger）和米根霉（Rhizopus oryzae）的葡萄糖淀粉酶。葡萄糖淀粉酶在工业上的主要用途是作为淀粉的糖化剂，是淀粉工业转化的主要水解酶。与α-淀粉酶一起广泛用于淀粉糖的生产和发酵生产领域。在酒精、白酒发酵生产中代替酒曲，可提高糖化率，提高出酒率。在啤酒加工中，可生产低糖干啤酒等。

（四）解枝酶（异淀粉酶）

解枝酶（异淀粉酶）又叫淀粉-1，6-葡萄糖苷酶，是能够专一地切开支链淀粉和糖原等分支点的α-1，6-糖苷键，从而形成长短不一的直链淀粉的一类淀粉酶。异淀粉酶的来源非常广泛，动植物和微生物中都发现了异淀粉酶。能够产生异淀粉酶的微生物主要包括产气杆菌（Aerobacter aerogene）、假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）等。

（五）环糊精转移酶

环糊精转移酶功能为切断淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子供体内部的α-1，4-糖苷键并将其转移到受体糖链上重新形成α-1，4-糖苷键。环糊精转移酶具有很低的水解活性，其转移活性体现在可使6～8个寡糖分子环化，并形成具有高度分支的糊精或环状极限糊精。

二、实验简介

本实验包括产淀粉酶芽孢杆菌的分离筛选、紫外诱变、深层发酵、黄曲霉固态发酵产糖化酶以及淀粉酶活力测定的几种不同方法等内容，学生学习后可全面掌握淀粉酶生产菌的获取、发酵等工艺技术，为今后从事酶制剂的生产奠定理论和实践基础。

实验11-1　产淀粉酶芽孢杆菌的分离

（一）实验目的

使学生掌握从自然界中分离淀粉酶产生菌及淀粉酶活力测定的方法，培养学生自行设计实验流程、判断实验结果的能力，并对所学习过的微生物实验方法进行综合技能训练。

（二）实验原理

许多微生物都能产生淀粉酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的淀粉酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物菌体，通过平板分离可获得细菌的单菌落，经芽孢染色可判断分离菌株是否为芽孢杆菌。将单菌落接种至淀粉平板，凡是具有产淀粉酶能力的芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围会出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液后，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色，由此可分离得到产淀粉酶的菌株。

液化型淀粉酶能将淀粉水解成糊精以及少量麦芽糖和葡萄糖，使淀粉对碘呈蓝色的臭特异性逐渐消失，该颜色消失的速度可衡量酶的活力。

（三）实验材料与装置

1.材料

自行分离产生淀粉酶的芽孢杆菌。

2.培养基

（1）斜面培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。

（2）平板分离培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。

（3）淀粉培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，可溶性淀粉2g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH 7.2。

（4）产淀粉酶发酵培养基：玉米粉8g，豆饼粉4g，蛋白胨0.5g，KH2PO40.5g，（NH4）2SO40.5g，Na2HPO40.8g，水100mL，pH自然。

3.试剂

（1）碘原液：称取11.0g碘和22.0g碘化钾，用少量水溶解，定容至500mL，储存于棕色瓶中。

（2）标准稀碘液：吸取2.00mL原碘液，加20.0g碘化钾，用水完全溶解后，定容至500mL，储存于棕色瓶中。

（3）2%可溶性淀粉溶液：称取2.00g可溶性淀粉，用少量水调成浆状物，边搅拌边缓缓加入70mL沸水中，用水分次冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒入其中，搅拌加热到完全透明，冷却定容至100mL。此溶液当天配制当天使用。

（4）0.02mol/L、pH 6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称取Na2HPO4·12H2O 45.23g，柠檬酸（C6H8O7·H2O）8.07g，用蒸馏水溶解定容至1000mL，配好后用pH计校正pH为6.0。

（5）标准糊精溶液：将0.03g糊精加入90mL煮沸的蒸馏水中，冷后定容至100mL，滴加甲苯3～5滴，冰箱保存。

（6）卢戈氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300mL。

（7）芽孢染色液：

①50g/L孔雀绿溶液；②50g/L番红水溶液；③苯酚品红溶液：碱性品红11g，无水乙醇100mL。取上述溶液10mL与100mL50g/L苯酚溶液混合，过滤。

4.仪器和其他装置

三角瓶、烧杯、量筒、容量瓶、试剂瓶、培养皿、试管、水浴锅、灭菌器、显微镜、摇床、白瓷板等。

（四）实验方法与步骤

1.分离

（1）采集土样，用无菌水制备1∶10土壤悬液。

（2）取上述土壤悬液5mL，注入已灭菌的试管中，将此试管放入80℃左右水浴中热处理10min，以杀死无芽孢杆菌及其他微生物，浓缩芽孢杆菌。

（3）用平板划线法分离单菌落，37℃培养24～48h。

（4）选取表面干燥、粗糙、不透明、污白色或微带黄色的单菌落进行编号。通过芽孢染色判断所选菌落是否为芽孢杆菌。

2.筛选

（1）从已判断为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种至含淀粉的斜面培养，再接种至淀粉平板。37℃培养24～48h，在淀粉平板上滴加卢戈氏碘液后测定菌苔的直径和水解圈的大小。

（2）选择水解圈直径与菌落直径比值大的菌落，接种至产酶培养基，37℃振荡培养48h，将发酵液过滤或离心，取上清液检测淀粉酶活力。

3.淀粉酶活力检测（Wohlgemuth Hagihara改良法）

（1）吸取1mL标准糊精溶液，置于盛有3mL标准稀碘液的试管中，混匀，作为比较颜色的标准管。

（2）于白瓷板空穴滴入1.5mL稀碘液。在25mm×200mm试管中，加入2%可溶性淀粉20mL，pH 6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液5mL，在60℃水浴中预热4～5min，加入稀释好的酶液0.5mL，充分混匀，立即计时，定时取0.5mL反应液加入预先滴有稀碘液的白瓷板空穴中，当颜色反应由紫色变成红棕色，与标准比色管颜色相同时，即到达反应终点，记录反应总时间即为液化时间。酶反应全部时间控制在2～2.5min，测定时照明采用日光灯。

（3）酶活力计算

以1mL酶液于60℃、pH 6.0的条件下，在1h内液化可溶性淀粉的克数来表示［g可溶性淀粉/（mL·h）］。

式中，n为酶液稀释倍数，20为可溶性淀粉溶液的毫升数，2%为可溶性淀粉浓度，0.5为测定时所用酶量，60为分钟数，t为测定时记录的液化时间。

实验11-2　淀粉酶生产用枯草芽孢杆菌的紫外诱变

（一）实验目的

1.观察紫外线对枯草芽孢杆菌产生淀粉酶的诱变效应。

2.学习并掌握物理诱变育种的方法。

（二）实验原理

物理诱变因子中以紫外线辐射的使用最为普遍，其他物理诱变因子则受设备条件的限制，难以普及。一般用于诱变育种的物理因子有60Co、γ-射线和高能电子流β-射线等。紫外线作为物理诱变因子用于工业微生物菌种的诱变处理具有悠久的历史，尽管几十年来各种新的诱变剂不断出现并应用于诱变育种，但到目前为止，对于经诱变处理后得到的高单位抗生素产生菌种中，有80%左右是通过紫外线诱变后经筛选而获得的，因此，对于微生物菌种选育工作者来说，紫外线作为诱变因子还是应该首先考虑的。

紫外线的波长在200～300nm，但对诱变最有效的波长仅仅是253～265nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线波长大约有80%是254nm。紫外线诱变的主要生物学效应是由DNA变化造成的，DNA对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA结构变化的形式很多，如DNA链的断裂、碱基破坏等，但其最主要的作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。

经紫外线损伤的DNA能被可见光照射而复活，因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射，故经紫外线照射后样品需要黑纸或黑布包裹。另外，照射处理后的孢子悬液不要储放太久，以免突变在黑暗中修复。

（三）实验材料

菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CICC 10033，中国工业微生物菌种保藏管理中心。

培养基：牛肉膏、蛋白胨、固体培养基、淀粉培养基。

药品：牛肉膏、蛋白胨、NaCI、可溶性淀粉、碘液。

仪器及其他用具：试管、移液管、三角瓶、量筒、烧杯、20W紫外灯、磁力搅拌器、离心机、灭菌器、超净工作台等。

（四）实验方法与步骤

1.按要求配制培养基，并将培养基、生理盐水及所需器皿灭菌，备用

2.诱变

取已培养20h的活化枯草芽孢杆菌斜面一支，用10mL生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的三角瓶中，强烈振荡10min，以打碎菌块，离心（转速3000r/min）15min，弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2次，最后制成菌悬液，用血细胞计数板在显微镜下直接计数。调整细胞浓度为108cfu/mL。

将淀粉琼脂培养基熔化后，冷却至45℃左右倒平板，凝固后待用。正式照射前开启紫外灯预热10min。取制备好的菌悬液4mL移入直径6cm的无菌培养皿中，放入无菌磁力搅拌捧，放在磁力搅拌器上、20W紫外灯下30cm处，然后打开皿盖边搅拌边照射，照射时间分别为1min、2min、3min、5min。可以累积照射，也可以分别照射不同时间。

在红外灯下分别取未照射的菌悬液（作为对照）和照射过的菌悬液各0.5mL进行不同程度的稀释，取最后三个稀释度的稀释液涂布于淀粉培养基平板上。每个稀释度涂3个平板，每个平板加稀释液0.1mL，用无菌玻璃涂布棒涂匀，37℃下培养48h（用黑布包好平板）。注意在每个平板背后要标明处理时间、稀释度、组别等信息。

3.计算存活率及致死率

将培养48h后的平板取出进行细胞计数。根据平板上的菌落数，计算出对照样品1mL菌液中的活菌数。

4.观察诱变效应

在平板菌落计数后，分别向菌落数在5～6个的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈，分别测量透明圈直径与菌落直径并计算比值（HC值），与对照平板进行比较，根据结果说明紫外线对枯草芽孢杆菌产生淀粉酶诱变的效果，选取HC值大的菌落移接到新鲜牛肉膏斜面上培养。此斜面可作复筛用。

（五）实验结果与分析

将实验结果按表1-11-1要求如实填入，并分别计算出存活率、致死率。

表1-11-1　紫外线处理对枯草芽孢杆菌的影响

（六）实验注意事项

紫外线操作应在暗室中或晚上进行，诱变后应避光保存菌种，避免回复突变。

实验11-3　枯草芽孢杆菌发酵生产α-淀粉酶

（一）实验目的

1.学习掌握α-淀粉酶发酵试验的基本原理、控制条件和操作方法。

2.学习α-淀粉酶酶活力测定的具体操作方法。

（二）实验原理

α-淀粉酶（α-amylase，EC3.2.1.1）能分解淀粉（天然底物通常是α-1，4-糖苷键），能以随机的方式切割淀粉分子内部的α-1，4-葡萄糖苷键，产物为糊精、低聚糖和单糖类，使淀粉的黏度迅速降低而还原力逐渐增加。α-淀粉酶作为安全高效的生物催化剂，广泛应用于食品、酿造、制药、纺织和石油开采等诸多领域。特别是广泛应用在食品与酿造的许多生产领域，如酶法生产葡萄糖及果葡糖浆、酒精及味精等生产中，是目前国内外应用最广、产量最大的酶制剂之一。α-淀粉酶的主要生产菌有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和淀粉液化芽孢杆菌等。

目前，工业上主要是利用深层发酵法，大规模生产α-淀粉酶。我国从1865年开始应用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BF-7658生产α-淀粉酶，当时仅无锡酶制剂厂独家生产。现在国内生产酶制剂的厂家已发展到上千个，其中约有近一半的工厂生产α-淀粉酶，总产量上万吨。目前工业化生产所使用的菌株大多是由野生菌株经多次诱变的突变株。

近几年来，耐高温α-淀粉酶的研究相当活跃，国外生产耐高温α-淀粉酶发展较快，已从嗜热真菌、高温放线菌，特别是从嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilust）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformus）等中分离得到了耐高温的α-淀粉酶菌种。国内虽已开展了耐高温α-淀粉酶的研究工作，但目前仍以枯草杆菌菌株生产α-淀粉酶为主。

（三）实验材料

1.微生物菌种

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CICC 10080，中国工业微生物菌种保藏管理中心。

2.培养基与试剂

（1）马铃薯培养基（PDA）、种子培养基、发酵培养基。

（2）马铃薯、蔗糖、琼脂、可溶性淀粉、豆饼粉、玉米粉、Na2HPO4、（NH4）2SO4、NH4Cl、CaCl2。

（3）原碘液：称取11.0g碘和22.0g碘化钾，用少量水溶解，定容至500mL，储存与棕色瓶中。

（4）稀碘液：吸取2.00mL原碘液，加20.0g碘化钾，用水完全溶解后，定容至500mL，储存与棕色瓶中。

（5）2%可溶性淀粉溶液：称取2.00g可溶性淀粉，用少量水调成浆状物，边搅拌边缓缓加入70mL沸水中，用水分次冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒入其中，搅拌加热到完全透明，冷却定容至100mL。此溶液当天配制当天使用。

（6）磷酸缓冲液（pH 6.0）：称取Na2HPO4·12H2O 45.23g，柠檬酸（C6H8O7·H2O）8.07g，用蒸馏水溶解定容至1000mL，配好后用pH计校正pH为6.0。

（7）0.1mol/L盐酸。

3.仪器设备

超净工作台、电热恒温振荡培养箱、恒温培养箱、分光光度计、酸度计、高压灭菌锅、电炉。

4.其他材料

三角瓶、无菌吸管、精密pH试纸、比色用白瓷板。

（四）实验方法与步骤

1.培养基的制备

（1）制备马铃薯培养基斜面

培养基组成：马铃薯20g，蔗糖2g，琼脂2g，水100mL，pH自然。

配制方法：马铃薯去皮，切成块煮沸30min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，熔化后补足水至100mL，分装于试管，于121℃灭菌20min，摆成斜面。

（2）制备种子培养基

配制种子培养基：豆饼粉3%，玉米粉2%，Na2HPO40.6%，（NH4）2SO40.3%，NH4Cl 0.1%，pH 6.5。

分装入250mL三角瓶中（50mL/瓶），于121℃灭菌20min，冷却后备用。

（3）制备发酵培养基

配制发酵培养基：可溶性淀粉8%，豆饼粉4%，玉米浆2%，Na2HPO40.4%，（NH4）2SO40.3%，NH4Cl 0.1%，CaCl20.2%，pH 6.5。

分装入500mL三角瓶中（50mL/瓶），于121℃灭菌20min，冷却后备用。

2.液体种子的制备

（1）斜面菌种活化

取枯草芽孢杆菌菌苔1环，移接于马铃薯培养基斜面上。

置于37℃恒温箱中培养12～16h，备用。

（2）制备液体种子

取经活化的枯草芽孢杆菌斜面菌种2环，移接于装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中。

置于电热恒温振荡培养箱中于37℃振荡培养16h，备用。

3.α-淀粉酶的发酵

（1）α-淀粉酶发酵

吸取液体种子培养物5mL，移接于装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中。

置于电热恒温振荡培养箱中于37℃振荡发酵培养36h。

每隔4h取样，测定发酵培养液的pH，OD和酶活性，并做记录。

（2）α-淀粉酶活性测定

吸取20mL可溶性淀粉溶液，加入磷酸缓冲液5.0mL，摇匀后，置于60℃恒温水浴中预热8min。

加入1mL稀释好的酶液，立即计时，摇匀，反应5min。

立即用移液枪吸取1.0mL反应液，加到预先盛有0.5mL盐酸溶液和5.0mL稀碘液的试管中，摇匀，并以0.5mL盐酸溶液和5.0mL稀碘液为空白，于660nm波长下，用10mm比色皿迅速测定其吸光度（A），根据吸光度从下表查得测试酶液的浓度。

酶活力计算：

式中：X1—酶活力（U/mL），c—测试酶样浓度（μ/mL），n—样品的稀释倍数。

表1-11-2　吸光度与测试α-淀粉酶酶浓度对照表

续　表

（五）实验结果与分析

1.记录枯草芽孢杆菌发酵产生α-淀粉酶的整个试验过程。

2.记录所测定的发酵液α-淀粉酶活性，并根据测定结果阐述枯草芽孢杆菌的产酶特点。

3.将每隔4h取样所测得的发酵培养液的pH，OD和酶活性结果，绘制成发酵过程曲线。

（六）实验注意事项

1.α-淀粉酶酶活力测定方法：根据国家标准局发布的方法进行（GB8275-2009）。

2.酶活力定义：1mL酶液于60℃，pH 6.0条件下，1h液化1g可溶性淀粉为1个酶活力单位。

3.测定α-淀粉酶活性的可溶性淀粉和标准糊精液，应做到当天使用当天配制，并注意防腐和冰箱低温保存。

实验11-4　葡萄糖淀粉酶的发酵与活力测定

（一）实验目的

1.学习淀粉酶的固态发酵方法。

2.学习菲林试剂法测定葡萄糖淀粉酶活力的方法。

（二）实验原理

葡萄糖淀粉酶工业上常称为糖化酶。根霉、曲霉等霉菌中含有的糖化酶能将淀粉质水解为葡萄糖，进而被微生物利用。糖化酶活力的高低，往往决定着淀粉的利用率高低。

葡萄糖淀粉酶又称γ-淀粉酶，作用于淀粉时，从非还原端开始逐次切下一个葡萄糖分子，它不仅能分解α-1，4-糖苷键，而且能分解α-1，6-糖苷键（但速度慢得多）。因此，葡萄糖淀粉酶能将直链淀粉和支链淀粉全部水解为葡萄糖。

（三）实验材料

1.菌种：黄曲霉（Aspergillus f lavus）CICC 2410，中国工业微生物菌种保藏管理中心。

2.原料：麸皮。

3.主要设备：超净工作台、灭菌器、三角瓶、培养箱。

4.试剂

（1）费林试剂：

甲液：称取15g硫酸铜（CuSO4·5H2O），0.05g次甲基蓝，用水溶解并稀释至1000mL。

乙液：称取50g酒石酸钾钠，54g氢氧化钠，4g亚铁氰化钾，用水溶解并稀释至1000mL。

（2）0.1%标准葡萄糖溶液：准确称取1g无水葡萄糖（预先于100～105℃烘干），用水溶解，加5mL浓盐酸，用水定容至1000mL。

（3）pH 4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液

2M乙酸溶液：量取118mL冰乙酸，加水稀释至1000mL。

2M乙酸钠溶液：称取272g乙酸钠（CH3COONa·3H2O），用水溶解并稀释至1000mL。

pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液：将2M乙酸溶液和2M乙酸钠溶液等体积混合。

（4）0.1N氧氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，用水溶解并稀释至1000mL。

（5）2%可溶性淀粉溶液：准确称取2g可溶性淀粉（预先于100～105℃烘干），加少量水调匀，倾入80mL沸水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100mL。

（四）实验方法与步骤

1.黄曲霉发酵

在250mL三角瓶中加麸皮5g，水10mL，于121℃灭菌20min，冷却后接入黄曲霉孢子，摇匀，使孢子分散。30℃培养2d，菌丝布满表面，将麸皮摇拌，接触空气，再培养2～3d。倾出，铺在纸上，置于鼓风干燥箱中低温干燥，得风干麸曲。

2.待测酶液的制备

称取5.0g酶粉（预先培养好的含葡萄糖淀粉酶的固体曲）（以绝干计），置入250mL烧杯中，加90mL水和10mLpH 4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液，搅匀，于30℃水浴中保温浸取0.5h，每隔15min搅拌一次。用脱脂棉过滤，滤液待测酶液。

3.酶活力测定

（1）糖化液的制备：吸取25mL2%可溶性淀粉溶液，置入50mL容量瓶中，于30℃水浴预热10min。准确加入5mL待测酶液，摇匀，立即计下时间，于30℃水浴准确保温糖化1h。迅速加入15mL0.1N氢氧化钠溶液，终止酶解反应。冷却至室温，用水定容至刻度。

同时做一空白液：吸取25mL2%可溶性淀粉溶液，置入50mL容量瓶中，先加入15mL0.1N氢氧化钠溶液，然后准确加入5mL待测酶液，用水定容至刻度。

（2）定糖

空白液测定：吸取费林试剂甲、乙液各5mL，置入100～150mL三角瓶中，准确加入5mL空白液，并用滴定管预先加入适量的0.1%标准葡萄糖溶液，使后滴定时消耗0.1%葡萄糖溶液在1mL以内，摇匀，于电炉上加热至沸，立即用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作须在1min内完成。

糖化液测定：准确吸取5mL糖化液代替5mL空白液，其余操作同上。

（3）酶活力计算

酶粉糖化酶活力定义：1g绝干酶粉，在30℃，pH 4.6，1h内水解可溶性淀粉为葡萄糖的克数。

式中：V0—加5mL空白液时10mL菲林试剂消耗0.1%标准葡萄糖溶液的体积，mL；

　V—加5mL糖化液时10mL菲林试剂消耗0.1%标准葡萄糖溶液的体积，mL；

　W—酶粉称取量，5.0g，以绝干计；

　1000—g换算成mg。

（五）实验结果与分析

在不同的培养时间取样测定酶活力，记录糖化酶随发酵时间的变化情况。

（六）实验注意事项

1.糖化温度对糖化酶活力影响很大，故糖化温度应严格控制。

2.糖化酶活力与可溶性淀粉的质量有关，故活力表示时应予以注明可溶性淀粉的出厂。

参考文献

［1］李彧娜.微孢根霉华根霉变种CICIM F0088生淀粉酶系的研究［D］.无锡：江南大学，2010.

［2］李海峰.海洋酵母普鲁兰类酵母一种新型生淀粉酶生产和特性研究［D］.青岛：中国海洋大学，2007.

［3］石鹤.微生物学实验［M］.武汉：华中科技大学出版社，2010.

［4］杨汝德.现代工业微生物学实验技术［M］.北京：科学出版社，2009.

［5］陈珊，刘东波，李凡.微生物学实验指导［M］.北京：高等教育出版社，2011.

［6］黄秀梨.微生物学实验指导［M］.北京：高等教育出版社，1999.

（编者：杨海龙）