实验二 细菌革兰氏染色技术
一、实验目的
（1）学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的革兰氏染色法。
（2）了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
（3）初步认识细菌的形态特征。
二、实验原理
（1）单染色法：只有一种染料着色，只能观察微生物的大小、形状和细胞排列状况，不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。由于菌体极小，折光率低，在显微镜下不容易看清，将其染色，使菌体和背景之间反差增大，折光率增强，就容易看清，简单染色法只用一种染料着色。
（2）复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。
常用的染色方法有：革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法等。
其中革兰氏染色的原理：革兰氏染色法是细菌染色中一种重要的鉴别染色法。通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌和阴性菌两大类。当细菌用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘是媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫－碘的复合物，从而增强染料与细菌的结合力。当用乙醇（或丙酮）脱色处理时，两类细菌的脱色效果不同。
G－菌肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂质，故用乙醇等有机溶剂脱色时类脂质融解，增加了细胞的通透性，使初染的结晶紫－碘的复合物易于渗出，经番红或沙黄复染呈红色。
G＋菌细胞壁结构致密，用脱色剂处理后，肽聚糖层孔径缩小，通透性降低，故细菌仍保留初染时的紫色。
三、实验器材
（1）菌种：大肠杆菌（E．coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）24h营养琼脂斜面培养物，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）12～18h营养琼脂斜面培养物。
（2）染色液和试剂：草酸铵结晶紫、卢戈氏碘液、95%乙醇、番红液、乙醇－乙醚（3∶7，V／V）混合液、香柏油、生理盐水。
（3）器材：普通光学显微镜、载玻片、接种针（环）、擦镜纸、酒精灯、吸水滤纸、火柴、玻璃铅笔、玻片夹或镊子等。
四、实验步骤
（一）步骤
1．简单染色法
涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检。
2．革兰氏染色法
涂片→干燥→固定→结晶紫初染→水洗→碘液媒染→水洗→95%乙醇脱色→水洗→番红复染→水洗→干燥→镜检。
（1）涂片：
①取洁净载玻片1块，用接种环在中央位置滴1～2滴生理盐水，再用接种环以无菌操作的方法分别取少量各菌种分别涂于载玻片的生理盐水中，涂抹成薄膜状。
②三区混合涂片法：在玻片的左右端各加1滴水，用无菌接种环挑少量金黄色葡萄球菌或枯草芽孢杆菌（A菌）与左边水滴充分混合成仅有金黄色葡萄球菌的区域，并将少量的菌液延伸至玻片的中央。再用无菌的接种环挑少量大肠杆菌（B菌）与右边水滴充分混合成仅有大肠杆菌的区域，并将少量大肠杆菌菌液延伸至玻片中央，在中央区域形成含有两种细菌的混合区，如图2－1所示。
图2－1 三区涂片法示意
A．金黄色葡萄球菌或其他革兰氏阳性菌 B．大肠杆菌 C．A、B两菌混合区
（2）干燥：室温中自然干燥，或于小火上方烘干。
（3）固定：涂菌面朝上，将载玻片来回通过火焰3次。
（4）初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1min，倾去染液，流水冲洗至无紫色。
（5）媒染：先用新配的卢戈氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1min，后水洗。
（6）脱色：斜置载玻片，滴加95%酒精进行脱色15～20s，后立即用流水冲洗。
（7）复染：除去残水后，滴加番红或沙黄染色液，染2～3min，水洗后用吸水纸吸干。
（8）镜检：观察染色结果并绘图。G＋菌呈蓝紫色，G－菌呈红色。
图2－2 革兰氏染色过程[1]
3．革兰氏染色的注意事项
（1）涂片不宜过厚，勿使细菌密集重叠影响脱色效果，否则脱色不完全造成假阳性。镜检时应以视野内均匀分散细胞的染色反应为标准。
（2）火焰固定不宜过热，以玻片不烫手为宜，否则菌体细胞易变形。
（3）滴加染色液与酒精时一定要覆盖整个菌膜，否则部分菌膜未受处理，亦可造成假象。
（4）乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。如脱色过度，则G＋菌被误染成G－菌；而脱色不足，G－菌被误染成G＋菌。在染色方法正确无误前提下，如菌龄过长，死亡或细胞壁受损伤的G＋菌也会呈阴性反应，故革兰氏染色要用活跃生长期的幼龄培养菌。
五、实验记录
（1）记录所观察到的三种细菌革兰氏染色结果。
（2）按比例大小绘出显微镜下三种细菌的形态。结果记录：
六、思考题
（1）要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？关键是哪一步？为什么？
（2）现有一株未知杆菌，个体明显大于大肠杆菌，请你鉴定该菌是革兰氏阳性还是革兰氏阴性，如何确定你的染色结果的正确性？
（3）在下表中依次填入革兰氏染色所用染料的名称，并填上革兰氏阳性和革兰氏阴性菌在每步染色后菌体所呈的颜色。在不影响革兰氏反应的前提下，哪一步可被省略？
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一、荚膜染色技术
（一）实验目的
学习荚膜染色的原理和方法。
（二）实验原理
荚膜是包围在菌体细胞外面的一层黏液性物质，其主要成分为多糖类物质。由于荚膜与染料之间的亲和力弱，不易着色，观察荚膜时多用负染色法或称背景染色法，即将菌体与背景分别染色，将不着色而透明的荚膜衬托出来，所以这种染色法又称为衬托染色法。荚膜很薄，容易收缩，故在制片时不用加热的方法进行固定。
（三）实验器材
（1）菌种：金黄色葡萄球菌。
（2）染色液和试剂：绘图墨水，1%甲基紫水溶液，6%葡萄糖水溶液，甲醇，乙醇－乙醚（3∶7，V／V）混合液。
（3）器材：载玻片、盖玻片、吸水滤纸、显微镜、擦镜纸等。
（四）实验步骤
（1）制混合液：加一滴6%葡萄糖液于洁净载玻片一端，然后用接种环挑取少量菌体与其混合，再加一环墨水，充分均匀。
（2）涂片：取另一块载玻片作为推片，将推片平整的一端的边缘置于混合液前方，然后稍向后拉，当推片与混合液接触后，轻轻左右移动，使之沿推片接触的后缘散开，而后以30°角迅速将菌悬液推向玻片的另一端，使其成匀薄的一层。
（3）干燥：空气中自然干燥。
（4）固定：将涂片浸入纯甲醇中固定1min。
（5）干燥：在酒精灯上方干燥。
（6）染色：用甲基紫染色1～2min。
（7）水洗：用自来水轻轻冲洗，自然干燥。
（8）观察：油镜下观察，背景灰色，菌体紫色，菌体周围的清晰透明圈为荚膜。
（五）实验记录
绘图说明你所观察到的细菌的菌体和荚膜的形态。
（六）思考题
（1）为什么荚膜染色中用甲醇固定而不用加热固定？
（2）通过荚膜染色法染色后，为什么被包在荚膜里面的菌体着色而荚膜不着色？
二、芽孢染色技术
（一）实验目的
学习芽孢染色的原理和方法。
（二）实验原理
芽孢又叫内生孢子，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、位置，芽孢囊是否膨大等特征都是鉴定细菌的依据。由于芽孢壁厚、透性差、不易着色，当用结晶紫单染色时，菌体呈紫色，芽孢是无色透明。
芽孢染色法是根据细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同，用不同的染料进行染色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，当用弱碱性染料孔雀绿在加热的情况下进行染色时，此染料可以进入菌体及芽孢使其着色，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。若再用番红复染，则菌体呈红色而芽孢呈绿色。
（三）实验器材
（1）菌种：枯草芽孢杆菌24h肉汁斜面培养物。
（2）试剂和染料：香柏油、乙醇－乙醚（3∶7，V／V）混合液、5%孔雀绿水溶液、0．5%蕃红水溶液。
（3）其他器材：显微镜、擦镜纸、载玻片、接种环、酒精灯、火柴、吸水滤纸等。
（四）实验步骤
（1）制备菌悬液：加1～2滴水于小试管中，用接种环挑取2～3环菌苔于试管中，搅拌均匀，制成浓的菌悬液。
（2）染色：加2～3滴孔雀绿于小试管中，并使其与菌液混合均匀，然后将试管置于沸水浴的烧杯中，加热染色15～20min。
（3）涂片固定：用接种环取试管底部菌液数环于干净载玻片上，涂成薄膜，然后将涂片通过火焰3次温热固定。
（4）脱色：水洗，直至流出的水无绿色为止。
（5）复染：用蕃红染液染色2～3min，倾去染液并用滤纸吸干残液。
（6）镜检：干燥后用油镜观察，芽孢呈绿色，芽孢囊和营养细胞为红色。
注意：所用菌种应掌握菌龄，以大部分细菌已形成芽孢为宜；取菌量不宜太少。
（五）实验记录
绘图说明你所观察到的细菌的菌体和芽孢的形态。
参考文献
［1］唐丽杰．微生物学实验［M］．哈尔滨：哈尔滨工业大学出版社，2005．
［2］沈萍，陈向东．微生物学实验［M］．4版．北京：高等教育出版社，2007．
［3］周德庆．微生物学实验教程［M］．2版．北京：高等教育出版社，2002．
【注释】
[1]引自百度图片：http：／／image．baidu．com／i？ct＝503316480＆z＝＆tn＝baiduimagedetail＆ipn ＝d＆word＝革兰氏染色步骤。
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