酵母菌的杂交试验

实验十一　酵母菌的杂交试验

一、实验目的

掌握酵母菌有性杂交育种的基本原理和方法。

二、实验原理

杂交是在细胞水平上进行的一种遗传重组方式。有性杂交，一般指不同遗传型的两性细胞间发生的接合和随之进行的染色体重组，进而产生新遗传型后代的一种育种技术。凡能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌，原则上都可采用与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进行育种。

酿酒酵母有其完整的生活史（图11－1）。从自然界分离到的，或在工业生产中应用的菌株，一般都是双倍体细胞，而发生有性结合的酵母必须是单倍体，而且要求接合型不同。因此，无论哪种类型的酵母在进行有性杂交时，首先必须经过单倍体化，即将酵母培养在生孢子培养基中，使其产生子囊，经过减数分裂后，在每一个子囊内会形成4个子囊孢子（单倍体），其中2个为a型，2个为α型。获得单倍体后，需对其接合型进行验证，一般使用标准接合型的单倍体酵母和待测菌株进行有性杂交，能和标准的a型酵母进行接合的为α型，反之则为a型。为了便于检测杂交子，一般要求用于实验的单倍体具有遗传标记。用蒸馏水洗下子囊，用机械法（加硅藻土和石蜡油后在匀浆管中研磨）或酶法（用蜗牛消化酶等处理）破坏子囊，再进行离心，然后把获得的子囊孢子涂布平板，就可以得到由单倍体细胞组成的菌落。把来自不同亲本、不同性别的单倍体细胞通过离心等方式使之密集地接触，就有更多机会出现种种双倍体的有性杂交后代。它们与单倍体细胞有明显的差别（见表11－1），易于识别。在这些双倍体杂交子代中，通过筛选，就可得到优良性状的杂种。

图11－1　酿酒酵母的生活史

表11－1　酿酒酵母的双倍体和单倍体细胞的比较

有性杂交的步骤一般包括：二倍体亲本的选择、单倍体化、接合型验证、遗传标记制作、有性杂交、杂种的获得和性能的测定。

本实验从两个已知接合型和遗传标记的单倍体酵母为出发菌，通过有性杂交获得杂交子。

三、实验器材

（一）菌种

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）单倍体腺嘌呤缺陷型（ade－）菌株Z1，接合型为a；酿酒酵母单倍体组氨酸缺陷型（his－）菌株Z2，接合型为α。

（二）培养基

（1）完全培养基：蛋白胨2%，酵母浸粉1%，葡萄糖2%，琼脂2%，pH 6．0，117℃灭菌10min。

（2）基本培养基：葡萄糖2%，NaCl 0．1%，K2HPO40．1%，MgSO4·7H2O 0．05%，（NH4）2SO40．5%，处理琼脂2%，蒸馏水配制，pH 6．0，121℃灭菌15min。

（3）生孢子培养基：麦氏培养基。葡萄糖0．1%，KCl 0．18%，酵母浸膏0．25%，CH3COONa 0．82%，琼脂2%，pH自然。115℃灭菌15min。

（三）实验器材

试管、离心管、离心机、吸管、培养皿、三角烧瓶、涂布棒等。

四、实验步骤

（一）单倍体的杂交

（1）取Z1和Z2斜面菌种1环，分别接种于5mL完全培养基中，28℃静置培养24h。

（2）分别取0．1mL Z1、Z2菌株培养液，混合接种于5mL完全培养基中，置28℃培养6～8h。在显微镜下观察是否形成哑铃状接合子，继续培养至24h。

（二）杂交子的检出

将培养物离心（3 500rpm，10min），收集菌体，将菌体用生理盐水离心洗涤2次，最后悬浮在10mL生理盐水中。将悬浮液适当稀释，取0．1mL涂布于基本培养基平板上。同时做Z1、Z2菌株的对照平板。将全部平板置28℃培养2～4d，观察每个平板的菌落生长情况。在基本培养基平板上，Z1和Z2菌株不生长，无菌落长出，而涂布有混合培养物的基本培养基平板上有菌落长出，该菌落可认为是杂交子。将其接入完全培养基斜面中保存，待鉴定。

（三）杂交子的验证

（1）将斜面保存的待测菌株1环接种于5mL完全培养基中，28℃培养24h，重复传代培养三次。

（2）离心收集菌体，用生理盐水离心洗涤两次。将菌泥堆放于生孢子培养基平板上，于22～25℃培养2～4d，观察子囊孢子形成情况，同时做Z1和Z2菌株生孢子对照。如果待测菌株生孢子，即为杂合二倍体菌株（杂交子）。Z1和Z2菌株不生孢子。

五、实验记录

（1）绘制显微镜下接合子的形态。

（2）杂交子的验证结果。

六、思考题

（1）如何获得酵母菌的单倍体孢子？

（2）简述酵母菌有性杂交的基本过程。

参考文献

［1］周德庆．微生物学教程［M］．2版．北京：高等教育出版社，2002．

［2］杜连祥，路福平．微生物学实验技术［M］．北京：中国轻工业出版社，2011．