ε－聚赖氨酸生产菌株筛选与发酵工艺研究

实验二十八　ε－聚赖氨酸生产菌株筛选与发酵工艺研究

一、实验目的

学习ε－聚赖氨酸生产菌的筛选方法与发酵工艺。

二、实验原理

ε－聚赖氨酸（ε－PL）是一种均聚氨基酸，它是一种新型生物防腐剂，具有强烈的抑菌能力，且安全性能高，可以用于多种食品的保鲜。它是日本酒井平一和岛昭二两位博士在大量筛选有价值的放线菌时发现的一种新型聚合物。赖氨酸含有两个氨基，聚合时有α－位和ε－位两个位点的聚合产物，而ε－位的聚合物具有较强的抑菌能力。ε－聚赖氨酸是含有25～30个赖氨酸残基的阳离子聚合多肽，当聚合度低于十肽，会丧失抑菌活性。具有高抑菌活性的ε－聚赖氨酸的分子量在3 600～4 300之间。抑菌机理主要表现在破坏微生物的细胞膜结构，引起细胞的物质、能量和信息传递中断，最终导致细胞死亡。

图28－1　ε－多聚赖氨酸结构式

聚赖氨酸抑菌谱广，在酸性和微酸性环境中对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌均有一定的抑菌效果，尤其对其他天然防腐剂不易抑制的革兰氏阴性的大肠杆菌、沙门氏菌抑菌效果非常好。聚赖氨酸在食品中应用时，多与其他物质配合使用，如酒精、有机酸、酯等。聚赖氨酸在食品中多用于肉制品、高盐食品、快餐、色拉、蛋糕等食品的保鲜，效果较好，具有广阔应用前景。

三、试剂与器材

（一）菌种

白色链霉菌（Streptomyces albus），抑菌实验鉴定菌：枯草芽孢杆菌。

（二）试剂

无水葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、甲基橙、ε－聚赖氨酸（Sigma公司）、（NH4）2SO4、Na2HP4·12H2O、NaH2PO4·12H2O、MgSO4·12H2O、K2HPO4、KH2PO4。

（三）溶液配制

0．7mmol／L磷酸缓冲液（pH 6．9）：称取Na2HP4·12H2O 0．260 9g，NaH2PO4· 12H2O 0．109 2g，用少许蒸馏水溶解，定容至1L，调pH至6．9。

10mmol／L甲基橙试剂：准确称取甲基橙3．273g，用蒸馏水定容至1L。

聚赖氨酸标准溶液：称取聚赖氨酸的溴化物10mg，用0．7mmol／L磷酸缓冲液溶解并定容至100mL。

（四）培养基

斜面培养基（g／L）：葡萄糖10，蛋白胨2，酵母浸膏5，琼脂15，pH 6．8，121℃灭菌20min。

种子培养基（贝特纳培养基）：葡萄糖5，酵母浸膏5，pH 6．8，121℃灭菌20min。

发酵培养基：葡萄糖50，酵母浸膏5，（NH4）2SO410，MgSO4·12H2O 0．2，K2HPO48，KH2PO46，pH 6．8，121℃灭菌20min。

（五）实验仪器

紫外分光光度计、电子分析天平、恒温培养箱、电热干燥箱、旋转式摇床、pH计、蒸汽灭菌锅。

四、实验步骤

（一）单孢子菌液制备

取一环菌体接种于斜面培养基上，30℃静置培养，待孢子成熟后，于斜面上加入无菌生理盐水10mL，用接种环刮下孢子，放入含有玻璃珠的150mL三角瓶中，振荡，打断孢子链，用塞有少量棉花的无菌漏斗过滤，除去菌丝。同时血球计数板计数，适当稀释使孢子浓度为108个／mL。

（二）单菌落培养

吸取以上制备的孢子悬液0．1mL，涂布于装有15mL斜面培养基的平板上，30℃倒置培养3～4d。

（三）抑菌圈实验

用2×YT固体培养基倒平板。下层先倒好，等到凝固后，在培养皿下面做上标记。取200μL枯草芽孢杆菌菌液与上层培养基混合，摇匀，使枯草芽孢杆菌均匀分布在培养基内。用10mL移液枪移取10mL培养基做上层培养基。凝固后用管碟法将200μL发酵上清液用移液枪放入牛津杯中，同时用灭过菌的液体发酵培养基作为空白，放在37℃培养箱中培养16h。当出现边缘清晰的抑菌圈，利用游标卡尺测定抑菌圈大小。

（四）单菌落保存

挑选抑菌圈较大的菌落转接于保藏斜面，30℃恒温培养7d，待斜面完全被孢子覆盖，4℃保存备用。

（五）摇瓶发酵

将平板筛选得到的菌株通过摇瓶发酵测定不同菌株的ε－聚赖氨酸产量，以选育最佳生产菌株。

（1）斜面培养：将4℃保存的斜面菌种，接种至斜面培养基中，30℃培养5～7d，至长满灰色孢子。

（2）种子培养：用接种铲挑取1cm2菌苔接入装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，30℃，220r／min，旋转式摇床培养48h。

（3）以6%接种量将种子培养液接入装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中培养，30℃，220r／min，旋转式摇床培养72h。测定细胞干重与产物含量。

（六）生物量测定

将滤纸先在105℃烘箱中烘至恒重，称重后放入漏斗。取10mL发酵液，在8 000rpm条件下离心10min，保存上清液，沉淀用无菌水洗涤2次，放入已经烘干的滤纸上过滤，将滤纸和菌体在烘箱中烘至恒重，称量并计算菌体重量。

（七）ε－聚赖氨酸产量测定

（1）用0．7mmol／L磷酸钠缓冲液（pH 6．9）将聚赖氨酸溶液稀释成不同浓度（0．05，0．1，0．15，0．2，0．25，0．3，0．35，0．4mg／L）的使用液。

（2）取如上不同浓度的聚赖氨酸溶液2mL与10mmol／L的甲基橙2mL混合，混合液振荡反应30min，4 000rpm离心15min，取上清液稀释，以磷酸缓冲液为空白样，在465nm下测其吸光度A465，绘制标准曲线。

（3）发酵液离心后取上清液，适当稀释后，取2mL上清液加入2mL 10mmol／L甲基橙，混合液振荡反应30min，4 000rpm离心15min，取上清液稀释。用磷酸缓冲液为空白对照，用分光光度仪在波长465nm下测量吸光度A465。

五、实验结果记录

（1）每个菌株抑菌圈的大小。

（2）每个摇瓶的细胞干重。

（3）ε－聚赖氨酸标准曲线制作时不同浓度的A465，并绘制标准曲线。

（4）产物测定的A465，计算每个摇瓶发酵的ε－聚赖氨酸产量。

六、思考题

（1）菌悬液制备时为什么要用玻璃珠振荡？

（2）比较不同菌株的细胞生物量与产物量，两者之间有没有相关性？

参考文献

［1］陈长华．发酵工程实验［M］．北京：高等教育出版社，2009．

［2］姜俊云，贾士儒，董惠钧，等．搅拌转速和pH对聚赖氨酸发酵的影响［J］．生物加工过程，2004，2（2）：60—63．