显微镜的结构和光学原理及其操作方法

二、显微镜的结构和光学原理及其操作方法

（一）显微镜的结构（图1-1）和光学原理

显微镜分机械装置和光学系统两部分。

1．机械装置

（1）镜筒。镜筒上端装目镜，下端接转换器。镜筒为双筒，双筒全倾斜，其中一个筒有屈光度调节装置，以备两眼视力不同者调节使用。两筒之间可调距离，以适应两眼宽度不同者调节使用。

（2）转换器。转换器装在镜筒的下方，其上有4个孔，不同规格的物镜分别安装在各孔上。

（3）载物台。载物台为方形，中央有一光孔，孔的两侧装有夹片，载物台上还有移动器，位于载物台的底部，移动器的作用是夹住和移动标本片，可横向（X螺旋）和纵向（Y螺旋）移动。

（4）镜臂。镜臂支撑镜筒、载物台、聚光器和调节器。

（5）镜座。支撑整台显微镜，其上有光源开关、光亮控制钮、指示灯、集光器。

（6）调节器。本仪器调节的是载物台的位置，有的仪器调节的是镜筒的位置。它包括镜架两侧大、小螺旋调节器（调焦距）各一，前转上升，后转下降。可调节物镜和所需观察的物体之间的距离。

图1－1　显微镜的结构

1．目头；2．目镜；3．观察镜固紧螺钉；4．转换器；5．物镜；6．载物台；7．聚光镜升降手轮；8．聚光镜固紧螺钉；9．聚光镜（带孔径光阑）；10．下聚光镜；11．光亮控制钮；12．光源开关；13．横向移动手轮；14．纵向移动手轮；15．微动调焦旋钮；16．粗动调焦旋钮；17．标本片夹持器；18．镜臂；19．镜座

2．光学系统及其光学原理

（1）目镜。装于镜筒上端，由两块透镜组成。目镜把物镜造成的像再次放大，不增加分辨力，各台显微镜备有3个不同规格的目镜，分别是7倍（7×）、10倍（10×）和16倍（16×），可根据需要选用。一般可按与物镜放大倍数的乘积为物镜数值孔径的500～700倍，最大也不能超过1 000倍的选择。目镜的放大倍数过大，反而会影响观察效果。

（2）物镜。物镜装在转换器的孔上，物镜有低倍（4×、10×）、高倍（40×）及油镜（100×）。物镜上标有：N．A．1．25、100×、“OI”、160/0．17、0．16等字样，其中N．A．1．25为数值孔径；100×为放大倍数；“OI”表示油镜，即oil immersion；“160/0．17”中160表示镜筒长，0．17表示要求载玻片的厚度；0．16为工作距离。

油镜与其他物镜不同，其载玻片与油镜之间不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。常选用香柏油作为油浸介质，因香柏油的折射率n＝1．52，与玻璃相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样就减低了视野的照明度（图1－2）。

图1－2　油浸工作原理

利用油镜不但能增加照明度，更主要的是能增加数值孔径（numerical aperture，N A）。显微镜的放大效能由其数值孔径决定。数值孔径＝n×sin（α/2），其意为玻片和物镜之间的折射率乘上光线投射到物镜上的最大夹角（即镜口角）（图1－3）的一半的正弦。光线投射到物镜的角度越大，则显微镜的效能越大，该角度的大小决定于物镜的直径和焦距，n是影响数值孔径的因素，空气的折射率n＝1，水的折射率n＝1．33，香柏油的折射率n＝1．52，用油镜时光线入射α/2为60°，则sin60°＝0．87；

图1－3　物镜的光线入射角

以空气为介质时：N A＝1×0．87＝0．87

以水为介质时：N A＝1．33×0．87＝1．16

以香柏油为介质时：N A＝1．52×0．87＝1．32

显微镜的性能还依赖于物镜的分辨力，分辨力即能分辨两点之间的最小距离的能力。它与数值孔径成正比，与波长成反比。即数值孔径愈大，光波波长越短，则分辨力愈大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出来。因此，一个高的分辨力意味着一个小的可分辨距离，这两个因素呈反比关系。通常有人把分辨力说成是多少微米或纳米，实际上是把分辨力和最小分辨距离混淆了。通过增大数值孔径、缩短波长均可提高显微镜的分辨力，使目的物的细微结构更清晰可见。但事实上可见光的波长（0．38～0．7μm）是不可能缩短的，只有靠增大数值孔径来提高分辨力。

显微镜的分辨力用可分辨的最小距离表示：

能辨别两点之间最小距离＝

式中，λ——光波波长。

我们肉眼所能感受的光波平均长度为0．55μm，假如数值孔径为0．65的高倍物镜，它能辨别两点之间的距离为0．42μm。而在0．42μm以下的两点之间的距离就分辨不出，即使用倍数更大的目镜，使显微镜的总放大率增加，也仍然分辨不出。只有改用数值孔径更大的物镜，增加其分辨力才行。例如用数值孔径为1．25的油镜时，能辨别两点之间的

因此，我们可以看出，假如采用放大率为40倍的高倍物镜（NA＝0．65）和放大率为24倍的目镜，虽然总放大率为960倍，但其分辨的最小距离只有0．42μm。假如采用放大率为90倍的油镜（NA＝1．25），和放大率为9倍的目镜，虽然总的放大率为810倍，但却能分辨出0．22μm间的距离。

显微镜的总放大倍数为物镜放大倍数和目镜放大倍数的乘积。

（3）聚光器。聚光器安装在载物台的下面，光线通过聚光器被聚集成光锥照射到标本上，可增强照明度和造成适宜的光锥角度，提高物镜的分辨力。当使用油镜工作时，光圈开得最大。

（4）照明：6V20W卤素灯，亮度可调。

（5）内藏式光源：220V、50Hz或110V、60Hz。

（二）显微镜的操作方法

1．竖起显微镜

（1）从镜头盒中取出物镜，并拧入转换器的孔中。

（2）把观察头装在显微镜弯臂上，并拧紧锁定螺丝以固定观察头。

（3）把目镜插入目镜筒。

（4）用孔径光栏的手柄将聚光镜定位，使其便于操作。

2．操作

（1）把显微镜的电源线插到适当接地的电源插座中。

（2）把照明器开关移到“ON（开）”的位置，滑动光控制变阻器，以获得适宜的照明亮度，当照明器处于工作状态时，电平指示器和指示灯都应亮着（初调时，亮度应较小；用油镜观察时，亮度应调大）。

（3）安放样品：把需要观察的样品放在显微镜的平台上，由平台夹爪将其稳固地夹紧，再旋转平台的X－Y方向的移动旋钮，把要观察的样品移动到平台上透光孔的中心。

（4）设定瞳孔眼距：握住观察头的表面平板向内、外移动目镜筒，直到双眼可以同时看清完整的视场为止，看一下此时的眼距（可以从观察头面板的刻度尺上读出），然后把两目镜筒的视度圈的相应数值调到对准镜筒刻度为止。

（5）显微镜的调焦：先用一只10×目镜和10×物镜进行初步观察。旋转粗调手轮提升平台直到样品的图像可以粗略地看到，然后再旋转微调手轮可以获得清晰的图像。在必要时，可松开自动调焦止动旋钮，使平台运动自如。这时应防止物镜接触样品，一旦结束调焦，就应当收紧自动调焦止动旋钮，这样就限制了平台移过定位点。再用另一只目镜观察图像，调节视度圈获得清晰图像，在需要时，旋转转换器，按需求改变物镜的放大倍率。

（6）如果必要，如下述调节显微镜以获得清晰的图像和舒适地观察，根据各种样品的密度和物镜的放大倍数，亮度亦应相应调节。如果光线明显偏黄，应在聚光镜的滤光镜座中放入蓝色滤色片。

（7）油镜的操作，如果用高倍镜未能看清目的物，可用油镜。先用低倍镜和高倍镜检查标本片，将目的物移到视野正中；用粗调节器将镜筒提起1．5～2cm，将油镜头转至镜筒下方，在载玻片上滴1滴香柏油。然后从侧面注视，用粗调节器缓缓降下镜筒，直至油镜头浸没于香柏油内，至几乎与载玻片相接触，但注意不能相碰，以免压破载玻片并损伤油镜头。然后从目镜中观察，首先调节光亮度，适当加大，用粗调节器极其缓慢地提升镜筒至出现物像为止。再用细调节器微调至物像清晰。油镜观察完毕，用擦镜纸将镜头上的油擦净，另用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭镜头，再用擦镜纸擦干。注意：二甲苯用量不宜过多，擦拭时间应短。

（8）注意：用完之后一定要将物镜旋转到最低倍数的那一个对准透光孔！