染色方法分类

三、染色方法分类

1．简单染色法

简单染色法又叫普通染色法，只用一种染料使细菌染上颜色，如果仅为了在显微镜下看清细菌的形态，用简单染色即可。即利用细菌与各种不同性质的染料如石碳酸复红、结晶紫、美蓝等具有亲和力而被着色的原理，采用一种单色染料对细菌进行染色，其具体步骤见本实验第五部分。

2．复染色法

用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。抗酸性染色法多在医学上采用。此处介绍革兰氏染色法。

革兰氏染色法是细菌学中很重要的一种鉴别染色法。它可将细菌区别为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类。其染色步骤如下：先用草酸铵结晶紫染色，经碘－碘化钾（媒染剂）处理后用乙醇脱色，最后用蕃红液复染。如果细菌能保持草酸铵结晶紫与碘的复合物而不被乙醇脱色，呈紫色者叫革兰氏阳性菌。被乙醇脱色用蕃红液复染后呈红色者为革兰氏阴性菌。染色成败的关键在于严格掌握酒精脱色程度和应使用新鲜幼龄的菌体进行涂片。其具体步骤见本实验第五部分。

3．芽孢染色法

用普通染色法制成的标本片，在显微镜下观察时，菌体着色而芽孢不着色。由于细菌芽孢着色较难，脱色也不易，因此芽孢染色的基本方法是采用着色力强的染料，如孔雀绿、石碳酸复红等加热染色，使菌体和芽孢都着色，再通过脱色剂使菌体脱色而芽孢不脱色。然后用其他染料使菌体再着色，这样菌体与芽孢形成不同颜色的鲜明对照。其操作步骤如下：

（1）制片：涂片、风干、固定。

（2）初染：滴3～5滴孔雀绿染色液于涂片上。用木夹夹住载玻片在酒精灯火焰上加热，使染液冒气但不沸腾，注意勿使染液蒸干，必要时可添加孔雀绿染色液。从冒气开始计算6～8分钟，倾去染液，待载玻片冷却后水洗至不再褪绿色为止。

（3）复染：用蕃红染色液染2～3分钟，水洗，风干。

（4）镜检：芽孢呈绿色，团体呈红色。

4．荚膜染色法

荚膜为多糖类物质，不易着色，故常用衬托染色法，即将菌体及背景着色以衬托出不着色的荚膜。操作步骤如下：

（1）制片：在干净载玻片的一端滴1滴蒸馏水或生理盐水，用接种环以无菌操作取少许菌落，制成细菌悬液，加1滴黑色素水溶液或绘图黑墨水与菌液混合。另取一块边沿平整的载玻片，将上述混合液顺载玻片表面刮过，使之成为一匀薄菌层并很快风干。

（2）固定：用纯甲醇固定1分钟。

（3）染色：用蕃红染色液冲去残留甲醇，染色0．5～1分钟，以细水流冲洗，再用滤纸小心地吸去余水。

（4）镜检：油镜下观察，背景呈黑色，细胞呈红色，衬托出不着色的荚膜。

5．鞭毛染色法

细菌鞭毛直径在10～20nm，超过了普通光学显微镜的分辨范围。鞭毛染色是使染料在鞭毛上沉淀堆积，加粗其直径便于在普通光学显微镜下观察。一般而论，以幼壮培养体产生鞭毛情况最好，故鞭毛制片常以短期内经多次移植的新鲜幼龄培养体为佳。鞭毛染色必须采用新配制的染色液以及高度清洁的载玻片，才能保证染色质量。

（1）初检：制水浸标本片检查细菌的运动性。方法是用接种环以无菌操作挑取少许菌落置于载玻片上已滴好的蒸馏水中，用镊子小心地从菌液一侧向另一侧盖上盖玻片，注意勿产生气泡。将水浸标本片置于高倍物镜下观察活菌是否运动，此时视野背景光线宜稍弱。如运动性很强，则可制片进行鞭毛染色。

（2）制片：在清洁载玻片的一端加蒸馏水1滴，用接种环挑取少许菌落，在载玻片水滴中轻沾使成菌悬液。倾斜载玻片使菌悬液下流，形成薄菌膜，然后平置载玻片使其自然干燥。

（3）染色：滴加鞭毛染色液A液染色3～5分钟，用蒸馏水轻轻冲洗。再用鞭毛染色液B液小心冲去残水后，滴加B液，并将载玻片在酒精灯上稍稍加热使微冒气，但不能干，染0．5～1分钟，然后小心地用水冲洗，风干。

（4）镜检：应在整个涂片上广泛寻找，因有时只在部分涂片上染出鞭毛，故需多观察几个视野。菌体呈深褐色，鞭毛呈褐色。