细菌总数的测定

二、细菌总数的测定

（一）直接计数法——血球计数板计数

利用血球计数板在显微镜下直接计数，这是一种常用的微生物计数法。此法是将待测细菌悬液或孢子液置于计数板的计数室中，由于计数室的容积是已知的，并有一定的刻度，因此可以根据在显微镜下观察到的微生物个体数计算出单位体积内微生物的总数。该法只适用于计算形态较大的酵母菌、藻类及孢子等。具体操作与原理参考实验三。

（二）染色涂片计数法

此法是利用涂片面积与视野面积之比来计算出样品中的微生物量。取稀释定容的菌液，滴在载玻片上并均匀涂布在一定面积上，经固定染色后，在显微镜下借相同倍数标定过的目测微尺，测得视野半径计算出视野面积，从已知总面积计算出视野总数。根据几个视野中的细胞平均值，计算出1ml样品中的细菌数。

（1）用接物测微尺测量油镜视野半径，用πr²计算出视野面积。一般油镜半径为0．08mm。

（2）用玻璃铅笔在载玻片中部划边长为2cm的正方形，面积为4cm²。

（3）用血球计数器中的0．01ml吸管吸取定容稀释菌液，置于玻片正方形中，均匀涂满整个正方形面积，干燥固定，再经1%石碳酸复红染色。

（4）观察计数。在涂片上观察数个视野，所取的视野要求分布均匀，统计每个视野中的菌数，求出平均值，根据下列公式计算。

式中：A——所观察视野平均菌数；

　　　S′——涂片面积；

　　　S——一个视野面积；

　　　B——稀释倍数。

（三）比浊度法

每种菌细胞能吸收和散射通过它们的光，每种菌的散射光强及吸收光度与细胞总数有相对应的关系。菌体愈多，悬液浊度愈大，则散射及吸收光愈多。利用分光光度计测定悬液减少光线透过的程度，用光密度（OD）表示，OD是透光率的对数函数，同细胞总数成正比。光密度可用分光光度计测定。测定时首先用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度－菌数的标准曲线。然后测出未知菌悬液的光密度，从标准曲线中查出相对应的菌数。此法比较简单而精确，但如果待测样品颜色太深或含其他悬浮物较多时，不宜使用此法。

此外，还可以利用比浊度仪进行测试，将细菌悬液与标准浊度管进行比较，以推算其菌数（表10－5）。

（1）将待测菌液用生理盐水或蒸馏水作一系列稀释，其浓度可略高于标准管。

（2）与浊度相当的标准管进行比较，记下此标准管所示的菌数。

（3）原菌液浓度的计算：

每毫升原液菌数（亿/ml）＝标准管所示的菌数×稀释倍数。

（4）比浊法操作注意事项：

1）待测菌液取1ml适宜，取量太少则误差较大，菌液用生理盐水作适当倍数的稀释，使其浓度略高于标准管，不宜相差悬殊。

2）标准管内是玻璃粉悬液，理化性质不够稳定，常因玻璃粉凝聚或粘附管壁而使浊度下降变淡，此时不宜使用。

3）比浊操作在光线明亮处进行，避免阳光直射。稀释要精确，比浊度时以相纸上黑线的清晰程度判断菌液浓淡，经左右置换进行核对两管透明程度一致时为准。每次检验样品不应过多和时间过长，以免导致视力疲劳，影响判断效果。

4）比浊管可放置室温或冰箱中保存，但不能冻结，有效期为一年。

表10-5　标准比浊管制法及相应菌数

注：W为重量（g）；V为体积（ml）

（四）微生物细胞的重量测定法

此法是测定单位体积培养物中细胞的重量，重量的测定可直接测定细胞的干重或湿重。干重通常是湿重的20%～25%，它比湿重与细胞总量的关系更直接。该法简单而相对准确，适用于菌体浓度较高的样品，但样品不能含有菌体以外的其他干物质。

1．微生物细胞湿重的测定

取一定容积的培养物，经离心或过滤，用无菌水或缓冲液冲洗1～2次，再离心弃去上清液，称重即可得到该培养物湿重。

2．微生物细胞干重的测定

依照上述方法得到微生物细胞后，转移到烘烤至恒重的蒸发皿内，再放到105～110℃烘箱内，烘干至恒重，放到干燥器内，冷却后称重即可得到微生物细胞干重。细胞一般具有吸湿性，故称量需迅速。

3．活性污泥的称重法

对于检验污水或废水生物处理系统中的活性污泥的生长情况及数量，常用总固体（MLSS）重量及挥发性固体（MLVSS）重量表示。

（1）MLSS重量的检验方法：MLSS的重量包括各种生物体、有机化合物、无机化合物及溶解性固体。首先，将蒸发皿洗净，放在105～110℃烘箱内约30分钟，取出放在干燥器内冷却30分钟后，在分析天平上称其重量，然后再烘烤称重至恒重，两次称重相差不超过0．000 4g；然后自构筑物中取100ml混匀的活性污泥，经离心后弃去上清液。用蒸馏水冲洗，再离心弃去上清液；用少量蒸馏水将沉淀污泥洗入上述恒重蒸发皿中，在100℃的水浴锅上蒸发至干，再放入105～110℃烘箱内约一小时取出，置于干燥器内冷却30分钟，称重；反复在105℃下烘干，冷却并称重直至恒重。最后根据公式计算重量：

式中：W₁——蒸发皿重量（g）；

　　　W₂——蒸发皿和总固体重量（g）；

　　　V——水样体积（ml）。

（2）MLVSS重量的检验方法：将上述已烘至恒重的干烧质，再置于500～600℃的马福炉内灼烧至恒重。一般需灼烧15～20分钟。待温度降至100℃以下，再取出蒸发皿移入干燥器内，停置30分钟冷却后称重。灼烧失重量即为挥发性固体，主要包括生物体及有机物重量。根据以下公式计算：

式中：W₂——蒸发皿和总固体的重量（g）；

　　　W₃——蒸发皿和总固体灼烧后的重量（g）；

　　　V——水样体积（ml）。

（五）自养菌数量的测定

利用二氧化碳或碳酸盐中的碳素为唯一碳源，利用光能或化能合成细胞物质者称为光能自养菌及化能自养菌。化能自养菌如硝化细菌、硫化细菌等，它们在琼脂平板上不易生长，故硝化细菌的计数可采用液体稀释法（MPN法）。

（1）制备计量用培养基，亚硝酸细菌采用氨氧化细菌计数用培养基，硝酸细菌采用亚硝酸氧化细菌计数用培养基。每支试管分装3ml，121℃下高压蒸汽灭菌15分钟。

（2）取1ml水样，按10倍作一系列稀释，通常稀释到10－6。取各不同稀释度菌悬液1ml，分别各向5支试管接种，共计接种25支试管。做不接种对照试管2～3支。置于28～30℃下培养4个星期。

（3）经培养后采用生化反应进行检查，若有亚硝酸细菌生长繁殖则培养基中有NO－₂积蓄。当加入1～2滴格里斯试剂时显红色或褐色。记录下各稀释度显色的试验管数。未接种对照管也滴入格里斯试剂，以证实是否有硝化细菌污染试剂或器皿，有时由于空气中少量的亚硝酸作用可能使未接种的对照管产生淡红色，因此检查时，应记录下颜色深于对照的接种试管数。若静置2～3分钟后不显色者可加入少量锌粉，如显红色说明NO－₂已被硝酸细菌氧化成NO－₃。

对于硝酸细菌的检查，同样滴加格里斯试剂后，不显色者说明培养基中由于硝酸细菌的生长繁殖，NO－₂已被氧化成NO－₃。将各种稀释度不显色管记录下。计算方法依照实验四二中的液体稀释法。