四、DNA含量的测定
DNA是重要的生物大分子，它不但是细胞的重要组成成分之一，还和蛋白质一起构成生命的主要物质基础，而且它的主要生物学功能是直接参与生物遗传信息的传递过程，是遗传的物质基础。DNA主要集中在细胞核中，主要由腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶4种碱基的脱氧核糖核苷酸组成。一般来说，不同生物其DNA含量不同。而同一种生物其DNA含量相对较稳定，因此可以通过测定DNA含量而相对区别，更进一步测定DNA分子中GO的克分子百分数，这是分类学中的一个重要指标。
如上所述，DNA存在于细胞中，所以必须先将细胞破碎，此外，生物材料中，除含有核酸外，还含有其他含磷物质和含糖物质，因此必须进行预先处理，方能测定DNA含量。
（一）生物材料的处理及核酸组分的分离
生物组织（细胞）通过匀浆器或超声波破碎后进行预处理，其目的是除去酸溶性含磷化合物。常用冷的5%～10%过氯酸（PCA）或三氯乙酸（TCA）处理粉碎（破碎）的生物材料，然后抽滤除去酸溶性部分抽提液，包括核苷酸及分子量小的寡核苷酸等。再将残留物用有机溶剂（如乙醚、氯仿等）除去脂溶性含磷化合物，抽提液中主要是磷脂类物质，留下的残渣中为不溶于酸的非脂类含磷化合物，包括DNA、RNA、蛋白质及少量其他含磷化合物。然后可按下列方法之一测定DNA含量（图10－1）。
图10－1 DNA分离的步骤
1．碱法
将酸不溶的非脂类化合物与1MNaOH（KOH）在37℃下保温过夜，RNA被降解为酸性核苷酸，而DNA不被分解，加入PCA或TCA（达到终浓度为5%～10%）酸化后，DNA即沉淀下来，上清液中为RNA的酸解产物。
2．冷酸法
将经酸和有机溶剂处理后的组织用1MPCA于40℃下处理18小时抽提出RNA，再用0．5MPCA在70℃下处理20分钟，抽提出DNA。
（二）DNA含量的测定
1．紫外吸收法
DNA分子中的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统具有紫外吸收高峰在260nm的特征，DNA的克分子消光系数（或称吸收系数）e（P）260nm（pH＝7．0）＝6 600，含磷量为9．2%，因此，每毫升溶液1μgDNA的光密度值为0．020。只有在OD260/OD280在1．9左右得出的结果较准确。
将样品配制成5～50μgDNA/ml的溶液，于紫外分光光度计上测定260nm吸收值，计算浓度：
（L为比色杯厚度）
如果待测样品中含有酸溶性核苷酸或低聚多核苷酸，则在测定时需加钼酸铵－过氯酸沉淀剂，以沉淀除去大分子核酸，测上清液260nm处吸收值作为对照。
2．二苯胺显色法测定DNA含量
DNA中的2－脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595nm处有最大吸收。DNA在40～400μg范围内，光密度与DNA的浓度成正比。如在反应液中加入少量乙醛，可提高反应灵敏度。
（1）DNA标准曲线的制定：取10支试管分成5组，依次加入0．4、0．8、1．2、1．6、2．0ml DNA标准溶液，添加蒸馏水至2．0ml，另取2支试管，各加入2．0ml蒸馏水作为对照，然后各加入4．0ml二苯胺试剂，混匀，于60℃恒温水浴中保温1小时，冷却后于595nm处进行比色测定。取平均值，绘制标准曲线。
（2）样品的测定：同标准曲线操作。
（3）DNA含量的计算
（4）二苯胺试剂：使用前称取1．0g重结晶二苯胺，溶于100ml分析纯冰乙酸中，再加入1ml过氯酸（60%以上），混匀待用，临用时加入1．0ml 1．6%乙醛。所配得试剂应为无色。
思考题
1．微生物生物量测定的意义是什么？
2．测定微生物生物量的方法有哪些？各自有何特点？
3．MPN测定法的原理是什么？
4．平板菌落计数法测定的生物量是哪部分？其计数的原则有哪些？
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