微生物监测技术的新发展

四、微生物监测技术的新发展

近年来，随着分子生物学技术、微电子技术等的飞速发展以及在微生物学各领域的应用，微生物监测技术也得到了迅猛发展，在微生物的分类鉴定、环境污染物的检测与毒性分析等方面都有长足的进步。

1.微生物传感器(microbial biosensor)

生物传感器是将生物化学传感同电子信号转换技术相结合的一种测量系统，它含有固定化生物物质(如酶、抗体、全细胞、细胞器或其联合体)并与一种合适的换能器紧密结合的分析工具或系统，可以将生化信号转化为数字化的电信号。生物传感器具有特异性识别生物分子的能力，并能通过一种合适的敏感换能器检测生物分子与分析物之间的相互作用。

微生物传感器是利用微生物作为敏感材料的生物传感器，因其具有许多优点，如高选择性、高灵敏度、较好的稳定性、低成本、能在复杂的体系中进行快速在线连续监测等，可以灵敏、动态地检测一些化学分析方法难以测定的参数，如急性毒性、致突变性等，在环境保护领域里有广阔的应用前景。

(1)微生物传感器的组成和工作原理

微生物传感器由分子识别部分(微生物膜，敏受器)和转换部分(换能器)组成。分子识别部分是微生物传感器选择性测定的基础，用分子识别部分去识别被测目标，可以引起某种物理变化或化学变化。转换部分将分子识别部分所引起的变化转化为信号。分子识别部分有微生物细胞、细胞器、酶、抗体、核酸以及其他有机物分子等。一般是将微生物细胞用吸附、包埋、共价交联等方法进行固定化处理，以使微生物细胞较长时间保持代谢活性和稳定性。根据产生信号的不同，可用相应的换能器构建不同的微生物传感器。

微生物传感器主要决定于敏感元件(分子识别单元)和待测物质之间的相互作用，环境化学物质与微生物膜接触，进入微生物细胞，细胞对化学物质进行代谢、转化，换能器则将这一过程转化为可读出并用定量关系的信号加以分析。微生物传感器检测的信号主要有电化学信号和光学信号，因而有电化学型和生物发光型两大类。前者主要检测微生物的呼吸活性或某些代谢物质(如代谢中间产物或终产物，如H₂、CO₂、NH₃等)含量，从而间接得知待测物质含量。后者主要是检测微生物的生物发光强度，以此来评判待测物质的毒性强度。

图13-1　微生物传感器工作原理示意图

(2)微生物传感器在环境监测中的应用实例

自1977年首台BOD传感器问世以来，已研制成功许多用于环境监测的微生物传感器，有些已商品化。这些传感器通过分析溶解氧、电流强度、发光强度等变化，可以灵敏地动态检测一些化学分析方法难以测定的参数，如急性毒性、致突变性等，待测物包括NH₃、H₂S、PO^－₃、NO₂^－、NO₃^－、CH₄、BOD、生物毒性等。所用的感受微生物如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、明亮发光杆菌、铜绿假单胞菌、硝化杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、聚球藻、酵母菌等。

①生化需氧量(BOD)微生物传感器:由微生物和氧电极组成，微生物耗氧量的大小取决于待测样品的BOD。当微生物传感器置于恒温缓冲溶液中，在不断搅拌下，溶液被氧饱和，生物膜中的微生物处于内源呼吸状态，溶液中的氧通过微生物的扩散作用与内源呼吸耗氧达到平衡，传感器输出一个恒定电流。当加入样品时，微生物由内源呼吸转入外源呼吸，呼吸活性增强，导致扩散到传感器的氧减少，使输出的电流减少，几分钟后，又达到一个新的平衡状态。在一定条件下，传感器输出电流值与BOD浓度呈线性关系。目前，BOD生物传感器已经商品化，测定一个样品只需10～30min，与传统的5日培养法结果有很好的相关性。图13-2为一种国内的BOD生物传感器示意图。

图13-2　BOD生物传感器示意图

②酚类微生物传感器:用酶电极安培传感器检测酚类化合物，电极表面的酶分子被氧(当酶是酚氧化酶如酪氨酸酶等时)或过氧化氢(当酶是过氧化氢酶时)氧化，接着被酚类化合物重新还原，酚类主要转化为苯醌或酚自由基，这些产物通常具有电化学活性，能在相对于饱和甘汞电极(SCE)0V以下的电位还原，还原电流与溶液中酚类化合物的浓度成正比。

③水体富营养化监测传感器:研究表明，水体富营养化的一个原因是氰细菌大量增殖，这些细菌能杀死水生植物，从而产生恶臭。由于氰细菌的细胞体内有藻青蛋白存在，其显示出的荧光光谱不同于其他的微生物，用这种对荧光敏感的生物传感器就能监测氰细菌的浓度，预报藻类急剧繁殖状况。

④阴离子表面活性剂(LAS)传感器:Nomura等人研制出一种用来探测阴离子表面活性剂浓度的生物传感器，包括能降解LAS的细菌和一个氧电极。工作原理为:当阴离子表面活性剂存在时，细菌的呼吸作用增加，导致溶解氧变化。

⑤氨传感器:由氧电极和两种硝化菌组成。在硝化菌与氨作用的过程中，同时消耗氧电极中的溶解氧，反应机理如下:

此外，微生物传感器在其他方面如监测臭气、监测环境诱变物、残留农药的监测以及对二氧化碳的检测等方面都有广泛的应用。

2.PCR技术

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)，简称PCR技术，是一种在体外快速扩增特定DNA序列的新技术。

PCR技术有着广泛的实际用途，在环境微生物检测中的应用有以下几方面:

(1)检测环境中的致病菌和指示菌

采用分离培养方法进行检测，不但费时而且无法检测一些人工难以培养的病原菌。采用PCR技术检测就克服了上述缺点，一般只要2～4小时就可以完成。

(2)检测环境中的基因工程菌株

在遗传工程的研究中会产生多基因菌，它们有些进入人类生活的环境中，检测基因菌对研究工作本身和生态安全来说都十分重要。运用PCR技术检测基因菌是非常方便的。

3.其他分子生物学技术

除多聚酶链反应(PCR)技术外，核酸杂交、核酸多态性、r RNA、rDNA序列分析、基因芯片、微生物醌指纹法、报告基因等分子生物学技术也广泛用于环境污染的微生物监测中。

核酸杂交技术是利用能与特定核苷酸序列互补的、已经标记的DNA(或RNA)片段(探针，probe)，检测样品中是否存在待测的特异核酸序列。杂交是指待测样品中提取的核酸分子与探针互补序列间的配对过程，杂交结果可通过探针的放射性或非放射性标记被灵敏地检测。该法操作简单、灵敏度高、应用广泛。

核酸多态性(polymorphism)技术是通过分析痕量的特殊DNA序列的微小差异，从分子水平上为微生物的多样性提供信息，可用于细菌的分型/群鉴定等方面。常用的核酸多态性分析技术有限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、随机扩增多态性DNA分析(randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)、扩增性rDNA限制性酶切片段分析(amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA)、变性梯度凝胶电泳(denaturing-gradient gel electrophoresis，DGGE)等。在实际应用中，核酸多态技术常与PCR技术结合起来使用，在环境污染的微生物监测领域发挥作用。如通过RFLP人们证实了多氯联苯PCB污染土壤中降解PCB微生物群落的多样性。

基因芯片是在微小基质表面集成大量的密集排列的基因探针(即探针阵列)，与检测分析仪器如激光共焦荧光成像系统、计算机相连。探针阵列以DNA的碱基配对、序列互补原则分辨单个核苷，完全匹配的阵列点荧光明亮，不匹配的阵列点荧光暗淡，分析所生成的荧光图谱就可快速检测目的基因序列，从而在短时间内完成大信息量的检测。

微生物醌指纹是指环境中的微生物醌组成，通常是以醌的摩尔比来表示。微生物醌是能量代谢过程中的电子传递体，分为呼吸型醌与光合型醌两类，前者如泛醌和甲基萘醌是呼吸链的电子传递体，存在于细菌等生物体内，后者如质体醌和维生素K₁是光反应电子传递链的电子传递体，存在于藻类等行光合作用的生物体内。由于不同微生物所含醌的种类和分子结构有差异，因此微生物醌指纹可以反映环境中微生物的群体组成以及微生物的多样性，如泛醌与甲基萘醌的摩尔比可以反映革兰氏阴性细菌与革兰氏阳性细菌之比，呼吸型醌与光合型醌之比则可反映环境中细菌与藻类之比等。另外，由于醌在微生物体内的含量相对稳定，微生物醌指纹也可用于测定环境中活性微生物的含量。

报告基因(reporter gene)技术是将报告基因标记在靶基因的启动子或转录起始部位，通过对报告基因特定表达产物的分析，检测细胞内重要功能基因或质粒的转录、翻译活性等。报告基因(reporter gene)通常是已知序列且表达产物可方便地定量检测的基因。目前应用较多的是GFP报告基因(gfp)和Lux报告基因(lux)。GFP(green fluorescent protein，GFP)报告基因的表达产物是一种蛋白荧光物质，发射光谱为λ_max=508～509nm，具有荧光稳定、检测方便、无毒，无需反应底物和辅助因子等优点，从而得到广泛应用。如将GFP报告基因插入烟草花叶病毒的基因组中，导入烟草植株，即可观察到病毒的感染和扩散过程，利用gfp重组根瘤菌则可清晰地记录根瘤菌对植物的侵染过程与共生情况，应用gfp构造荧光分枝杆菌则可很方便地观察到慢生型分枝杆菌感染细胞、组织、器官的部位和动态过程。lux为发光细菌的荧光素酶编码，用该报告基因构建出的重组微生物菌株，可检测萘、Hg²⁺、AsO₂^－、苯等环境污染物质。如将其与恶臭假单胞菌萘降解质粒融合，就可原位监测微生物对萘的降解。当微生物细胞与环境中的萘接触，萘进入细胞通过启动子诱导nal操纵子和lux基因的表达，在萘的矿化过程中即伴随着生物发光现象。该法十分灵敏，细胞接触萘10min后发光达到高峰并可持续24h以上。

环境污染的其他微生物监测方法还有很多，如以微生物的组成、数量、代谢活性、遗传特性、群落结构与功能为指标的一些监测方法等，都对生态环境健康评价有一定意义。微型生物群落监测方法(PFU法)，是应用泡沫塑料块作为人工基质收集水体中的微生物，通过测定该微生物群落结构与功能的各种参数来评价水质。生物指数法，是运用数理统计方法求得的反映生物群落种类和个体数量变化的数值，用以评价环境质量，如P/R指数、藻类污染指数法以及微生物群落的物种多样性指数(如Margalef指数、香农-韦勒多样性指数、连续比较指数等)。另外，测定特定的微生物酶活力以及代谢活性等，都可评价环境污染。如可测定硝化细菌的相对代谢率检测水和土壤中的有毒物，并以此评价环境污染物的生物毒性。

微生物监测可以弥补物理、化学方法的不足，同时具有其他生物监测方法所没有的优势。但和其他生物监测方法一样，微生物监测不能够精确反映污染的性质和数量。故在实际的环境监测中，应该将物理、化学、生物学方法有机地结合起来。再者，微生物易变异，抗性强，微生物作为环境污染的指示生物在应用上不及动物和植物广泛而规范。但毋庸置疑，微生物监测在环境污染监测中占有不可替代的地位。

思考题

1.对微生物有机氯农药对微生物的毒性主要表现在哪些方面?

2.污染压力下的微生物群落有何特征?

3.什么是生物富集?

4.一般环境污染的指示微生物有哪些?

5.粪便污染的指示微生物有哪些?各有何优缺点?

6.试述Ames试验的基本原理。

7.污染物生物毒性的微生物检测方法有哪些?发光细菌的微毒检测法有何优点?

8.试述微生物传感器的工作原理。

9.分子生物学技术应用在环境污染的微生物监测的哪些方面?