细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获取组织细胞的首次培养叫原代培养（primary culture）。原代细胞离体时间短，具有二倍体遗传性，在一定程度上反映了体内生长的特性，很适合作药物测试、细胞分化等实验研究。当培养的细胞增殖达到一定的密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1∶2或其他比率转移到另一个容器中扩大培养，为传代培养（passage culture）。传代培养的次数就是细胞的代数。
一、原代细胞培养
原代细胞培养是从事细胞培养工作最基本的技术，根据不同的实验目的及实验材料，解离或分离的方法和条件各不同。一般常用方法有二：组织块培养法及单层细胞培养法。
（一）单层细胞培养法
【实验用品】
1．器材 超净工作台、CO2培养箱、普通显微镜、倒置相差显微镜、水浴箱、离心机、解剖剪、解剖镊、眼科剪、培养皿、培养瓶、离心管、吸管、移液管、血细胞计数板、橡皮吸头、筛网、酒精灯、试管架、酒精瓶、棉球、无菌服、口罩、帽子等。
2．试剂 RPMI－1640培养液（含小牛血清和青霉素、链霉素）、0．25%胰蛋白酶消化液、Hanks液。
3．材料 新生乳鼠。
所有组织都含有一定量的细胞间质（纤维、基质等），妨碍细胞生长。用酶消化后，能除去间质，使组织容易分离成单个细胞或较小的细胞团，接种后细胞易于生长。下面以胰蛋白酶消化法原代培养初生乳鼠肺组织为例加以说明。
【操作步骤】
1．取材 取新生乳鼠1只，断髓处死，将尾巴提起，鼠身浸入装有75%乙醇的烧杯中3s，取出放置在灭菌的培养皿中移入工作台内。无菌操作取材。用碘酒、75%乙醇消毒胸廓部位皮肤。在胸廓正中线中位处，用弯头眼科镊夹起腹部皮肤，剪开腹腔和胸腔，并剪去部分胸壁以充分暴露胸腔，用眼科镊轻轻夹起粉红色肺组织并剪下放入另一培养皿中。用Hanks液清洗，去掉血污。
2．消化与分散组织块 把组织块移入无菌的青霉素瓶中并置于一角，用眼科直剪反复剪切组织成1mm3大小的小块，此过程需15min，再用Hanks液洗涤2或3次，至液体澄清方可。弃去Hanks液，加入5～10倍体积的0．25%胰蛋白酶溶液（pH7．4～7．8），盖好橡皮塞，置37℃水浴中消化20～30min，消化时每隔5min摇动一次，使组织块散开。视组织块变得疏松颜色略变白时，从水浴中取出，在超净工作台中用吸管轻轻吸去消化液，加入2～3ml完全培养基（血清中含有胰蛋白酶抑制剂），以终止消化。然后用吸管反复吹打，使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞状态，静置片刻，让未被消化完的组织自然下沉，然后将上层细胞悬液移入无菌离心管中备用。也可使细胞悬液通过筛网，以去除细胞混悬液中的细胞团，收集过筛网的单细胞悬液。
3．细胞计数与活力测定 离心管平衡后以800g离心5min，弃去上清液，加入适量培养液，用吸管反复吹打混匀后取样计数和进行活率测定。细胞计数与活力测定方法见第3章第二节。
4．接种培养 在培养瓶的侧面做好标记：培养物的名称、组号和日期。接种时，在25ml培养瓶中先加入1．5ml培养液，再接种1ml细胞悬液，用吸管轻轻混匀细胞后加盖瓶塞。持瓶做上下、左右十字形晃动后，移入37℃、5%CO2培养箱中开放培养。接种细胞数与细胞类型、活力有关，单层细胞培养接种浓度一般为1×105～1×106／ml细胞悬液。细胞活力好的，细胞接种数可少一些；胚胎细胞接种数较少，而分化程度高的二倍体细胞接种浓度要高些。
（二）组织块培养法
组织块培养是常用的简便易行和成功率较高的原代培养方法。把组织块切割成0．5～1mm3的小块后，由于组织块体积很小，在不加任何黏着剂的情况下，它们也能贴附于瓶壁上，然后细胞自组织块边缘向外长出生长晕，最后连接成片形成单层细胞。
【实验用品】 同（一）单层细胞培养法。
【操作步骤】
1．取材 从动物体内取材方法与单层细胞培养取材相同。将取出的组织（肝、肾或肺）移入无菌的培养皿中，用Hanks液冲洗，去除血污。把组织块移入无菌的青霉素瓶中并置于一角，用眼科直剪反复剪切组织成0．5～1mm3的小块，再用吸管加2或3滴细胞培养液，用吸管轻轻吹打，使组织块悬浮在培养液中。
2．接种培养 用吸管分次吸取组织块悬液，吸取时注意让组织块吸在吸管端部，以免吸得过高，黏附管壁而丢失。将组织块均匀排在培养瓶底壁上，翻转培养瓶，加入2～3ml培养液，塞紧瓶塞，做好标记置于37℃培养箱中2～3h后，待组织块略干燥能牢固贴于瓶壁上时，再缓慢地将培养瓶翻转，使培养液浸泡组织块，继续静止培养。
3．观察 静止培养2～3d后，每天小心取出培养瓶置于倒置相关显微镜下观察，已贴壁的组织块边缘有细胞长出。随后逐渐出现细胞分裂，细胞数量增多。可根据培养液颜色变化，补加和更换培养液，同时注意吸除漂浮的组织块。细胞生长良好时，10～15d可长成致密单层，这时可进行传代培养。
二、细胞传代培养
代培养细胞在瓶壁汇合后，需进行分离再培养，否则正常细胞因生存空间不足或细胞密度过大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。为了维持细胞的存活与生长，必须将原代培养瓶内细胞分离、稀释接种到新的培养瓶内继续扩大培养即传代培养。贴附型细胞与悬浮型细胞传代方式不同：贴附型细胞用酶消化方法传代，而悬浮型细胞可直接或离心传代。
【实验用品】
1．器材 普通显微镜、倒置相差显微镜、培养瓶、离心管、吸管、移液管、橡皮吸头、酒精灯、试管架、乙醇瓶、棉球等。
2．试剂 RPMI－1640培养液（含小牛血清和青、链霉素）、0．25%胰蛋白酶消化液、Hanks液。
3．材料 原代培养的乳鼠肺细胞。
【操作步骤】
1．贴壁细胞的传代
（1）洗细胞：取已生长成致密单层的乳鼠原代培养肺细胞，倒去培养液，加入2～3ml Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞后倾去，以去除残留的血清和衰老脱落的细胞及其碎片。
（2）消化：加入适量胰蛋白酶消化液浸泡细胞表面，倒置相差显微镜下观察细胞，当大部分细胞变成圆球形、细胞成片收缩、细胞间隙增大时可倒去消化液，加基础培养液或Hanks 1ml终止消化，用吸管有序地吹打瓶壁细胞，将消化下来的细胞于离心管中800g离心5min以去除酶液。
（3）接种：离心沉淀细胞后加海里完全培养液，混匀，分别接种到2～3个新的培养瓶内。每瓶补加培养液至5ml，37℃、5%CO2培养箱中培养。
注意事项：消化液作用多层细胞时，镜下出现蜘蛛网状时，立即终止消化；加消化液后，若2min内出现细胞脱落时，示消化过头；消化过程中见大片细胞脱落，示消化过头；消化过头时切勿倒去多余消化液，需加入等量的培养液吹打。
2．悬浮细胞的传代
（1）直接传代：让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清液吸掉1／3～1／2，用吸管吹打形成细胞悬液后，再传代。
（2）离心传代：在超净工作台内用吸管将培养瓶中的细胞吹打均匀，尤其是将那些半贴壁的细胞吹打起来；吸入离心管中，盖紧盖子，与另一离心管平衡后800g离心5min；回到超净工作台内，弃去上清液，加入适量新培养液，用吸管打匀，制成悬液后接种培养。
（3）若只为了保留细胞，则吸取少量细胞悬液至另一瓶中，加入适量新培养液即可，不必经离心步骤。
三、细胞的冻存与复苏
长期传代的细胞在暂时不用时可以用低温冷冻的方法保存，复苏后仍然可保持其原有的生物学特性和增殖活性。
【实验用品】
1．器材 同细胞培养，液氮罐，无菌细胞冻存管。
2．试剂 二甲基亚砜（dimathyl sulfoxide，DMSO），培养液、小牛血清、0．25%胰蛋白酶消化液。
3．材料 培养的HeLa细胞株。
【操作步骤】
1．细胞冻存
（1）选对数生长期细胞（必须证明无支原体污染），在收集细胞前24h换液1次。
（2）按前述方法将培养细胞制成细胞悬液，计数使细胞达5×106／ml左右密度，离心去上清，用1ml完全培养基重悬细胞，分装2个无菌管。
（3）用含20%小牛血清的培养液配制的20%DMSO冻存液，按与细胞悬液相同的量（0．5ml）一滴一滴地加入细胞无菌细胞冻存管中（DMSO的终浓度为10%），然后用吸管轻轻吹打令细胞悬浮。
（4）将冻存管置入纱布袋中，标明细胞名称和冻存日期。
（5）将细胞冻存管置4℃冰箱30min→－20℃冰箱30min→－70℃冰箱30min→液氮表面过夜，最后投入液氮中。
2．细胞复苏
（1）从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴1～2min，使之融化。
（2）用70%乙醇消毒管中后，用吸管吸收细胞悬液，注入离心管中再滴加5～10ml基础培养液。
（3）800g，离心5min，弃上清，加入完全培养基后装入培养瓶，37℃、5%CO2培养箱中常规培养。
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