酶类标志物测定

酶类标志物测定_生物化学检验技术

早在20世纪50年代就发现谷草转氨酶(glutamic-oxaloacetic transaminase,GOT)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)及其同工酶LDH 1和α-羟丁酸脱氢酶(α-hydroxybutyric dehydrogenase,HBDH)在诊断AMI上的灵敏度远远超过其他诊断。20世纪60年代初又肯定了肌酸激酶(creatine kinase,CK)在诊断AMI上比上述几种酶更早出现增高,特异性更强。20世纪70年代发现肌酸激酶同工酶(CK-MB)和LDH 1在诊断AMI上比其总酶特异性更强, CK-MB被认作诊断AMI的“金标准”,成为20世纪70年代至90年代初最常用的心肌损伤标志物。

(一)急性心肌梗死心肌酶活性改变的机制

当心肌细胞缺血时,心肌酶释放入血,其升高的时间和浓度与以下机制有关。

1.心肌酶的释放速度 心肌缺血导致能量代谢障碍,ATP生成减少,离子泵功能障碍,不能维持细胞内外渗透压平衡,导致细胞肿胀,特别是Ca2+进入细胞内,使膜孔隙增大,酶从细胞内逸出,其释放速度和数量受以下多种因素影响。①心肌细胞内外酶浓度差:浓度差越大,心肌细胞发生坏死或病变时血中酶浓度升高越明显;②酶在心肌细胞内定位与存在形式:心肌细胞受损时,胞质型GOT比线粒体型GOT更早释放入血;③酶蛋白分子的大小:心肌酶的释放速度与酶的分子量成反比。AMI时分子量大的LDH比分子量小的CK出现升高明显推迟。

2.心肌酶在细胞间隙的分布和运送 心肌酶经两条途径进入血液:①直接进入毛细血管而入血;②释放进入组织液后经淋巴系统入血。因此心肌受损后酶升高存在延迟期。

3.血中酶的清除 不同的酶在血中的清除时间不同,如LDH 1半衰期113h,CK半衰期15h,CK-MB半衰期12h。

(二)急性心肌梗死的酶类标志物

1.血清肌酸激酶活性测定

(1)概述:肌酸激酶(CK)是心肌中重要的能量调节酶,其催化作用是可逆的,即能将高能磷酸键从磷酸肌酸转移至ADP上生成ATP或从ATP上将高能磷酸键转移至肌酸,形成磷酸肌酸。磷酸肌酸分子中含高能磷酸键,是能量的重要储存形式。CK主要存在于需要大量能量供应的组织,如骨骼肌、心肌、脑组织等,以骨骼肌含量最多,其次是脑和心肌。

CK相对分子质量是86 000,是由脑型(B)和肌型(M)两种亚基组成的二聚体,可形成CKMM、CK-MB、CK-BB三种同工酶,CK-BB存在于脑组织,CK-MM和CK-MB存在于各种肌肉组织,不同肌肉两者的比例不同。骨骼肌中98%~99%是CK-MM,1%~2%是CK-MB;而心肌中约80%是CK-MB,20%左右是CK-MM,其他组织中CK-MB含量甚少,心肌CK-MB含量较高有相对的特异性。AMI后CK即大量释放入血液,2~4h血清中CK活性开始升高, 4~6h可超过正常上限,24h达峰值,48~72h恢复正常,诊断窗口期为AMI后5~72h。AMI发作后6~36h内,CK-MB敏感性为92%~96%,在心电图检测阴性AMI者的敏感性为79.7%。各种CK同工酶还可根据电泳分若干亚型,如CK-MB可分为CK-MB1和CK-MB2。正常血清中CK-MB1和CK-MB2是平衡的,当AMI时,心肌释放CK-MB2增多,在AMI后2h即上升,10~18h达峰值,12~24h下降。以CK-MB2>1.0U/L,CK-MB2/CK-MB1比值> 1.5为标准,诊断AMI的特异性可达95%。进入血液中的CK最终在肝被清除。

(2)CK及其同工酶检测方法:CK的测定方法有比色法、酶偶联速率法、荧光法及化学发光法,其中比色法和酶偶联速率法应用广泛。由CK催化的反应可知,比色法可以用磷酸肌酸或肌酸为底物,但以磷酸肌酸为底物比以肌酸为底物反应速率快2~6倍,故常用磷酸肌酸为底物进行测定。

(3)原理:肌酸激酶能可逆性催化磷酸肌酸和ADP,生成肌酸和ATP。肌酸与双乙酰和α-萘酚结合生成红色化合物。在一定范围内,红色的深浅与肌酸量成正比,从而求出血清中CK活性。在反应体系中加入Mg2+作激活剂,半胱氨酸供给巯基,保持CK活性中心必需基团不被氧化,氢氧化钡和硫酸锌沉淀蛋白并终止反应。

(4)试剂。

①混合底物溶液:临用前将试剂a、b、c等量混合,在此混合底物溶液9ml中,加入盐酸半胱氨酸31.5mg,调p H至7.4,置-20℃冰箱中保存可用1周。若空白管吸光度太高,表明有游离肌酸产生,不能再用。

a.Tris-HCl缓冲液(p H7.4):称取Tris 2.42g,溶于蒸馏水100ml中,加入0.2mol/L盐酸88.8ml,无水硫酸镁0.34g,调p H至7.4,室温可保存数月。

b.0.012mol/L磷酸肌酸溶液:称取磷酸肌酸钠盐43.6mg,加蒸馏水溶解至10ml,保存于-20℃冰箱,可用1个月左右。

c.0.004mol/L ADP溶液:称取ADP钠盐23.3mg,加蒸馏水溶解至10ml,保存于-20℃冰箱,可用1个月左右。

②50g/L硫酸锌溶液:准确称取ZnSO 4·7 H 2 O 5g,加蒸馏水溶解,并定容至100ml。

③60g氢氧化钡溶液:称取氢氧化钡[Ba(OH)2·8H 2 O]6g,溶于蒸馏水90ml中,煮沸数分钟,冷却后加蒸馏水至100ml,过滤。取50g/L硫酸锌溶液5ml,加少量蒸馏水和酚酞指示剂2滴,用氢氧化钡溶液滴定至粉红色。根据滴定结果,用蒸馏水稀释氢氧化钡溶液,使其恰好与等体积的硫酸锌溶液中和。

④贮存碱溶液:称取氢氧化钠30g,无水碳酸钠64g,加蒸馏水溶解,并稀释至500ml,置塑料瓶保存。

⑤α-萘酚溶液:称取α-萘酚400mg加贮存碱液10ml,须新鲜配制,否则空白管吸光度增高。

⑥双乙酰溶液:先配成10g/L水溶液,置冰箱保存,可用数月。临用前用蒸馏水做20倍稀释。

⑦1.7mmol/L肌酸标准液:准确称取无水肌酸22.3mg,加蒸馏水定容至100ml,置冰箱保存,可用数月。

(5)操作:按表11-1操作。

表11-1　CK测定(肌酸显色法)操作步骤

混匀,540nm波长处,用空白管调零,读取各管吸光度。

(6)单位定义:1ml血清在37℃与底物作用1h,产生1μmol肌酸为1个CK活性单位。

(7)计算

(8)参考区间:惯用单位0.5~3.6U/ml;国际单位8~60U/L。

(9)质量保证

①肌酸与α-萘酚及双乙酰产生红色化合物的反应并非肌酸所特有,精氨酸、胍乙酸及肌酐均可起反应。但除肾衰竭及某些代谢病外,通常此类物质含量很低,血清空白管吸光度与试剂空白管吸光度相差小,故一般不需做血清空白对照。

②血清CK活性>200U/L者,需用已知CK活性正常的血清稀释后重做,结果乘以稀释倍数。样品溶血不影响CK活性测定。

③试剂最好在实验前临时配制。α-萘酚应为白色或略带黄色的结晶,如颜色过深,应在乙醇中重结晶后再用。磷酸肌酸纯度要高,游离肌酸含量要低,空白管吸光度不应超过0.1。

(10)应用评价:肌酸比色法试剂易得,其灵敏度能满足临床诊断的需要,故应用广泛。但由于肌酸显色反应不稳定,且与α-萘酚及双乙酰产生红色化合物的反应并非肌酸所特有,精氨酸、胍乙酸及肌酐均可干扰测定,故IFCC推荐酶偶联法为参考方法。

(11)临床意义:血清CK活性测定主要用于AMI的诊断,为应用最广的心肌损伤指标之一。除AMI外,病毒、细菌、寄生虫感染引起的肌肉感染性疾病(如心肌炎、皮肌炎等)、脑血管意外、脑膜炎等中枢神经系统疾病,以及妊娠、心脏外科手术、治疗性电抽搐、心脏导管插入术、冠状动脉造影、腹腔手术、甲状腺功能减退及应用某些药物(如海洛因、可卡因、拉贝洛尔、两性霉素B、利多卡因、氯琥珀胆碱、奎尼丁和抗抑郁药等)CK也可升高。此外,如CK活性极度升高,多见于骨骼肌疾病和损伤,可高达参考区间上限的200倍。CK活性降低主要见于恶病质及神经性肌萎缩。

CK-MB的测定方法主要有电泳法、离子交换色谱法、免疫抑制法和放射免疫法,CK同工酶亚型检测需用等电聚焦电泳、层析等方法,但因耗时而难以普及。

近年来国内一些单位用免疫抑制法测CK-MB,其原理为在测定血清CK总活性之后,再向标本中加入抗M亚基的抗血清即M亚基抗体,后者可以和CK-MM及CK-MB中的M亚基形成抗原-抗体复合物,从而完全抑制M亚基的酶活性,使样本中的全部CK-MM活性和50%的CK-MB活性被抑制,而CK-MB及CK-BB中的B亚基活性不受影响,测定标本残留CK活性即为CK-MB及CK-BB中的B亚基活性。由于正常血清中几乎无CK-BB,因此测得残留CK活性可代表血清50%的CK-MB活性,将此值乘以2可代表CK-MB活性。此法简单迅速,但特异性差,如患者血清中还存在CK-BB或者异常CK时,将出现假阳性,故可作为过筛试验,如有疑问再用电泳法核实。

亦可采用琼脂糖凝胶电泳法分离测定血清CK-MB、CK-MM和CK-BB的相对比例。本法的精确度和灵敏度不及其他方法,且分离时间较长,不利于早期诊断,但由于其操作简单、价格低廉、分辨率高,特别是出现一些异常同工酶(如巨CK等),从电泳图谱上很容易发现,并通过光密度计进行定量,不会将CK-BB和各种异常同工酶认为是CK-MB而误诊,所以迄今仍为一些实验室所采用。

(12)参考区间:免疫抑制法,CK-MB<25U/L。电泳法,CK-MB为0%~3%;CK-MM为97%~100%;CK-BB为0。

(13)临床意义:1972年CK-MB首次用于临床诊断AMI。CK、CK-MB对诊断AMI的贡献卓著,是世界上应用最广泛的心肌损伤指标。检查CK-MB能较早期准确诊断AMI,具有较高的敏感性和特异性,是迄今为止诊断AMI的最佳血清酶指标,也是当今应用最广泛的心肌损伤标志物。其血清浓度和梗死面积有一定的相关,可大致判断梗死范围或诊断再梗死及检测再灌注及溶栓效果。溶栓成功后几小时内,CK-MB还会继续升高,称“冲洗现象”,此后即下降。总CK和CK同工酶在疾病时的变化(表11-2),特别在无Q波型AMI,常需其他检查协助临床医师诊断和鉴别诊断AMI。

表11-2　总CK和CK同工酶在疾病时的变化

CK-MB应用的局限性在于骨骼肌损伤时也可能释放出一定量的CK-MB,因此当血清CK-MB增高时,也应考虑有无非心肌来源的可能性。一般而言,CK和CK-MB在AMI发生后4~6h即可超过正常上限,临床上常同时测定CK-MB质量或活性与CK总活性的比值来鉴别非心肌梗死疾病和急性心肌梗死。CK-MB用质量表示称CK-MB百分相对指数(CK-MB percent relative index,CK-MB%RI)即CK-MB质量(μg/L)/CK总活性(U/L)比值,CK-MB用酶活性表示称百分CK-MB(%CK-MB)即CK-MB活性/CK总活性比值。AMI时,出现CK总活性升高,同时CK-MB质量>5μg/L,活性>25U/L,以及CK-MB%RI>5%,或CKMB%RI升高至4%~25%;而骨骼肌疾病和损伤以CK-MM升高为主,中枢神经系统疾病以CK-BB升高为主,两者的CK-MB%RI均<5%,据此可进行鉴别。

CK同工酶亚型分析可用于AMI的早期诊断。

CK-MB质量测定:测定方法及参考区间见本节蛋白类标志物。CK-MB质量测定避免活性检测中可能遇到的干扰,具有较好的灵敏度和准确性,并适合于自动化分析,优于其他检测CK-MB的方法。

(14)评价:CK及CK-MB作为诊断AMI的标志物具有以下优点。①操作简便、检测周期短、费用合理、不受溶血干扰,红细胞中无CK及CK-MB。②其浓度和AMI面积有一定的相关,可大致判断梗死范围。③能测定心肌再梗死。④能用于判断再灌注。但CK及CK-MB在诊断性能上尚存在以下缺点:①不能满足早期诊断要求,在AMI发作6h内,灵敏度较低。②特异性较差,特别难以和骨骼肌疾病、损伤鉴别。③在AMI发作6h以前和36h以后敏感度较低,只有CK-MB亚型可用于AMI的早期诊断,但由于尚无快速方便的检测方法,未能在临床常规开展。④对心肌微小损伤不敏感。

2.乳酸脱氢酶测定

(1)概述:乳酸脱氢酶是参与糖酵解和糖异生过程中催化乳酸和丙酮酸之间氧化还原反应的重要酶类,广泛分布于肝、心、骨骼肌、肺、红细胞等组织细胞的胞质和线粒体中。LDH的相对分子质量是135 000。LDH是由肌型(M)和心型(H)两种不同亚基组成的四聚体,形成LDH 1、LDH 2、LDH 3、LDH 4和LDH 5共5种同工酶,这两种亚基在氨基酸组成上有较大的差别,H型富含酸性氨基酸,M型富含碱性氨基酸,因此在电场中很容易分开,在同一介质中这5种同工酶的电泳速度不同,从阴极向阳极依次排列为LDH 5(M 4)、LDH 4(M 3 H)、LDH 3 (M 2 H 2)、LDH 2(MH 3)、LDH 1(H 4)。LDH同工酶有组织特异性,心、肾和红细胞的同工酶以LDH 1、LDH 2为主,肝和横纹肌以LDH 5为主,脾和肺以LDH 3为主。由于心肌中富含LDH 1,故LDH 1测定比总LDH更具心肌特异性。

当心肌损伤时,心肌细胞膜破裂,线粒体、胞质内物质外漏到细胞间液及外周血中。LDH和LDH 1在AMI发生后的8~12h开始升高,48~72h达峰值,8~12d缓慢恢复正常。由于LDH半衰期较长为50~170h,在其他酶活性已恢复正常时,LDH仍处于增高状态,若连续测定LDH对于就诊较迟、CK已恢复正常AMI的有一定诊断价值。心肌损伤时LDH 1和LDH 2均升高,LDH 1升高更明显,使LDH 2的相对比例下降,LDH 1/LDH 2比值>1.0是AMI的特异性指标(图11-2),且持续时间可达半个月左右,特别适用于就诊较晚的患者。

临床上还常选用HBDH作为AMI的诊断指标,HBDH是指用酮丁酸取代丙酮酸为底物测得的LDH活性,LDH 1和LDH 2比其他同工酶对酮丁酸有更大的活性,故HBDH活性相当于LDH 1和LDH 2。在诊断AMI时,HBDH特异性高于LDH总活性,但不及LDH 1同工酶。

(2)LDH及其同工酶检测方法:LDH总活性常以速率法进行测定,用乳酸脱氢酶催化乳酸和NAD+反应,生成丙酮酸和NADH,检测340nm处吸光度的改变测定LDH活性(L-P法)。同工酶的测定主要有免疫抑制法和电泳法。LDH 1常用免疫抑制法测定,即以抗M亚基抗体抑制除LDH 1外的其他LDH同工酶活性,再检测LDH活性即是LDH 1活性。琼脂糖凝胶电泳是目前进行LDH同工酶分离的常用方法,血清经琼脂糖凝胶电泳后显色,扫描各同工酶区带,求出各种LDH同工酶的相对含量,可了解5种同工酶的全况。

(3)原理:乳酸脱氢酶催化乳酸氧化生成丙酮酸,同时使NAD+还原为NADH,引起340nm处吸光度的增加,其增加速率与样品中LDH活性成正比。

(4)试剂:有商品试剂盒供应。例如,某试剂盒的成分与参考浓度如下。

①Tris-乳酸锂缓冲液:称取Tris(三羟甲基氨基甲烷)6.34g,乳酸锂5.04g,溶于约800ml蒸馏水中,置37℃水浴,使温度达到平衡后,在p H计下用1 mol/L HCl(约45ml)调节p H至8.9,再加入蒸馏水至1000ml,冰箱保存。

②底物应用液:按1ml Tris-乳酸锂缓冲液加4.2mg NAD+的浓度比例配制。

(5)操作:严格遵守商品试剂盒提供的操作规程。血清50μl,加37℃预温的底物应用液1.0ml,立即吸入生化分析仪,血清稀释倍数为21。

上机操作参数:根据各实验室仪器的型号及操作说明书设置。系数(K)3 376;孵育时间30s;监测时间60s;波长340nm;吸样量500μl;温度37℃。

(6)计算。

图11-2　AMI发生前后血浆LDH同工酶的电泳图

式中:6220为波长340nm处NADH的摩尔吸光度系数。

(7)参考区间:成年人109~245U/L。

(8)质量保证。

①红细胞含LDH为血清的100~150倍,故标本应严格避免溶血。

②测定LDH活性一般用血清。测定结果>1000 U/L时,应将血清稀释后重新测定。

(9)应用评价。

①L-P反应速率法的优点:该法是根据正向反应而建立,乳酸盐和底物溶液的稳定性较好,-20℃保存可稳定6个月以上。且两溶液的浓度对测定方法的影响最小。

②线性范围较宽:在LDH活性为726U/L以内线性良好。超过此值将标本稀释后再测。

③精密度好:LDH活性为65U/L和149U/L时的日间CV分别为5.8%和3.2%。

④特异性高:由于血清中非LDH的NAD+类氧化还原酶的内源性底物很少,加上样本的高度稀释,因此,这些酶的干扰作用可忽略不计。

(10)临床意义:临床上常以检测LDH总活性及LDH 1同工酶活性或相对比例来反映心肌损伤。临床检测AMI时,LDH不作为常规检查项目,在胸痛发作24h后测定LDH同工酶,作为CK-MB补充;由于LDH出现较迟,如果CK-MB或c Tn已有阳性结果,AMI诊断明确,就不必再检测LDH和LDH同工酶。

(11)应用评价:临床实践表明,LDH及LDH 1作为诊断AMI心肌损伤的标志物虽有一定价值,但也存在许多不足之处。①灵敏度低:由于LDH相对分子质量较大,在血中升高时间较迟,不能满足AMI早期诊断需要。同工酶谱测定费时,检测周期较长。②特异性差:由于LDH分布广泛,非梗死所致的快速心律失常、急性心包炎、心力衰竭都可使LDH轻度升高,红细胞LDH同工酶谱与心肌相似,任何原因所致的溶血均可使血清LDH和LDH 1升高。单纯用血清LDH活性升高诊断AMI的特异性仅53%,LDH 1/LDH 2比值可提高诊断的特异性,但仅为85%左右。③不能用于评估溶栓疗法和再灌注标志:LDH在血中升高持续时间长,并且溶栓时常伴有溶血使LDH升高,故无法根据LDH活性变化来判断溶栓是否成功、是否出现再灌注。现已有相对灵敏且特异的标志物,不主张以LDH及其同工酶作为心肌损伤标志物。

3.谷草转氨酶(GOT) GOT分布较广,主要存在于肝、心脏、骨骼肌和肾。GOT有两种同工酶,胞质型(GOTs)和线粒体型(GOTm)。在AMI发作6~8h,血清中GOTs活性增强,当出现GOTm时表明心肌细胞严重损伤。一般在5d内恢复正常。由于GOT不具有组织特异性,GOT诊断AMI敏感性为77.7%,特异性仅53.3%。敏感性不高,特异性差,目前已不主张GOT用于AMI诊断。

(三)AMI心肌酶时相变化及影响因素

1.AMI心肌酶时相变化 急性心肌缺血后,伴随心肌细胞缺氧程度的增加,心肌细胞能量代谢障碍逐渐加重,膜通透性增加,首先从心肌中释出无机离子,然后是小分子有机物,最后是大分子的酶蛋白。另外,心肌酶从细胞释放后,主要进入组织液,通过淋巴液回流入血。血清中心肌酶增高通常有延缓期(指从心肌细胞受损到血清中酶浓度增高的时间间隔),延缓期与梗死区的大小、酶的分子大小、酶从受损心肌释放的速度及酶在血液中稀释和破坏的程度有关。CK-MB的延缓期较短,为3~8h,CK为4~10h,LDH为6~12h。酶从心肌细胞释出后在一定时间血中含量达高峰,CK-MB的峰值通常出现在AMI后16~24h,CK为20~30h, LDH为30~60h。上升较快的酶,其维持增高的时间也较短,CK-MB只有1~4d,CK为3~ 6d,LDH可维持7~14d(表11-3)。

表11-3　急性心肌梗死血清酶活力增高时间和倍数

对单纯AMI病人,在不同时间采集标本可得出心肌酶活性和时间相变化关系(图11-3)。

图11-3　急性心肌梗死后不同时间内血清酶的活性变化

2.心肌酶活性的影响因素

(1)标本的处理:标本的采集、分离和储存过程都可能影响酶的活性。如压脉带使用时间过长可使CK增高,溶血可使LDH明显增高。采血后如不及时分离血清,红细胞内的酶可透过细胞膜释放到血清中,红细胞中无CK,但含有丰富腺苷酸激酶(adenylate kinase,AK),AK进入血清使某些用速率法测定CK的值升高。要求于采血后在1~2h分离血清。心肌酶在体外随存放时间和温度的变化其活性产生变化(表11-4),不能及时分析的标本,应注意存放时间和温度。

表11-4　心肌酶在不同温度下储存的稳定性(活性变化小于10%)

(2)性别:男性CK明显高于女性,系男性肌肉比女性发达所致。

(3)年龄:新生儿出生后24h内血清CK为成年人的3倍,婴儿期为2倍,青春期降至成年人水平。LDH在出生时为成年人2倍,随年龄增长逐步降低,到14岁时达到成年人水平。LDH 1在儿童期比成年人高,正常儿童可出现LDH 1>LDH 2。

(4)运动:剧烈运动可引起心肌酶升高,升高的程度和运动量及持续时间有关,也与运动者是否经常锻炼有关。