琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳_分子生物学实验手

琼脂糖凝胶电泳的分辨率较聚丙烯酰胺凝胶电泳低，但分离范围更广。100bp～60kb的DNA片段可以在不同浓度和构型的琼脂糖凝胶中分离。琼脂糖凝胶电泳不能分离＞750 kb的线性DNA分子。RNA分子可在非变性琼脂糖凝胶或变性琼脂糖凝胶中按大小分子不同而相互分开，常用的变性剂有甲醛、乙二醛等。

一、DNA琼脂糖凝胶电泳

【实验原理】

琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D-半乳糖和3，6脱水-L-半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，构成大网孔型凝胶。随着琼脂糖浓度的不同形成不同孔径的凝胶，用于分离、纯化相对分子量不同的DNA分子（表4-2）。DNA分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在处于电场中的琼脂糖凝胶中向正极移动。不同DNA分子因其所带的电荷数、相对分子量大小和构象不同，在同一电场中的电泳速度也不同，从而达到分离的目的。溴化乙锭（EB）是一种荧光染料，在紫外光照射下可发出波长590nm的红色荧光，DNA 分子与EB 形成荧光络合物后，其发射的荧光比原来要增强数十倍，常用于观察凝胶中DNA 条带的位置。

表4-2 不同浓度标准琼脂糖凝胶的DNA分离范围

【材料】

1．琼脂糖

2．电泳缓冲液配制

（1）50×TAE电泳缓冲液（1L）：配制如下。

① 称量下列试剂，置于1L烧杯中。

Tris　　　　　　　　242g

Na2EDTA•2H2O　　　　37.2g

② 向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。

③ 加入57.1ml的乙酸，充分搅拌。

④ 加去离子水将溶液定容至1L，室温保存。

（2）10×TBE电泳缓冲液（1L）：配制如下。

① 称量下列试剂，置于1L烧杯中。

Tris　　　　　　　108g

Na2EDTA•2H2O　　　7.44g

硼酸　　　　　　　55g

② 向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。

③ 加去离子水将溶液定容至1L，室温保存。

（3）TAE与TBE电泳缓冲液的主要特点：见表4-3。

表4-3 TAE与TBE电泳缓冲液的主要特点

3．10mg/ml溴化乙锭（EB） 配制如下。

① 称量1g溴化乙锭加入到100ml容器中。

② 加入去离子水100ml充分搅拌溶解。

③ 将溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存。

溴化乙锭的工作浓度是0.5μg/ml。注意：溴化乙锭是一种致癌物质，必须戴手套小心操作。

4．6×加样缓冲液（loading buffer） 30mmol/L EDTA，0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯菁，36%甘油水溶液，4℃保存。

5．已知相对分子质量的DNA标准品（DNA分子量标准，DNA Marker）

6．仪器设备 电泳仪、水平电泳槽、微波炉、紫外透射仪、凝胶成像分析系统、微量移液器等。

【操作步骤】

【结果分析】

将电泳后的琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统中观察电泳结果、分析结果并拍照。图4-1为pUC19质粒及其酶切产物电泳图。

图4-1 pUC19质粒及其酶切产物电泳图

M：DNA Marker；泳道1和2：质粒pUC19；泳道3和4：质粒pUC19的EcoR I单酶切产物

【注意事项】

1．注意溴化乙锭（EB）是一种强诱变剂，有致癌嫌疑，操作过程戴手套和口罩，并注意把实验中沾染EB 和未沾染EB的实验器具分开，防止EB交叉污染。溴化乙锭可在凝胶配制时加入或加入样品中，或者两者都不加，电泳结束后，将凝胶浸入溴化乙锭溶液中染色。

2．配胶和灌电泳槽需使用同一批缓冲液。因为pH 或离子强度很小的差别也会在凝胶前部造成紊乱，严重影响DNA片段的泳动。

3．微波炉加热时间过长，琼脂糖溶液会变得过热或剧烈沸腾。应选择加热至所有琼脂糖颗粒完全溶解需要的最短时间。

4．溴酚蓝与0.5kb大小的DNA 的泳动度相近，给泳动最快的DNA片段提供一个指示。

5．凝胶要用于印迹分析或将要回收DNA 条带时，每个样品必须使用一个新的枪头。

6．影响DNA 的迁移率的因素如下。

（1）DNA分子大小：DNA 分子越小，迁移越快。

（2）DNA分子构象：共价闭环DNA＞线形DNA＞开环DNA。

（3）琼脂糖浓度：浓度越低，迁移越快。

（4）两极间电压：电压越高，迁移越快。

7．DNA 区带不清晰，有可能是点样量小或过大，但也有可能是电压过高、凝胶有气泡、凝胶孔破裂等原因。

8．为了消除RNA的影响，可以在电泳前加RNA酶（约每10μl DNA加1μlRNA酶），37℃水浴30min。

9．在进行电泳的过程中，溴酚蓝有可能会变黄，这是由于电泳液使用过久或残留在电泳液中的凝胶变质引起DNA 结构改变或丢失所致。时常更换电泳液和刷洗电泳槽即可。

二、RNA甲醛变性凝胶电泳

【实验原理】 提取样品的总RNA后，一般根据RNA的凝胶电泳图来判断RNA的质量。由于RNA容易形成二级结构，所以常用甲醛变性胶来进行RNA电泳。甲醛与鸟嘌呤残基的单亚氨基基团形成不稳定的Schiff碱基对，这些化合物通过阻止RNA自身或RNA间的碱基配对而使RNA维持在变性状态，得到的电泳图能真实反映RNA的质量状况。不同分子大小的RNA在甲醛琼脂糖凝胶电泳中的迁移率不同，其迁移率与相对分子质量的对数呈反比关系，将RNA通过凝胶电泳按分子大小不同在凝胶中分离出来。

【材料】

1．琼脂糖、甲醛、甲酰胺、焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate，DEPC）处理水等。

2．10×MOPS电泳缓冲液（1L），配制如下。

① 称量41.8g 3-（N-吗啉代）丙磺酸（MOPS），置于1L烧杯中。

② 加约700ml DEPC处理水，搅拌溶解。

③ 使用2mol/L NaOH调整pH至7.0。

④ 加DEPC处理的1mol/L NaAc 20ml。

⑤ 加DEPC处理的0.5mol/L EDTA（pH 8.0）20ml。

⑥ 向烧杯中加入DEPC处理水定容至1 L。

⑦ 用0.45µm滤膜过滤除菌，室温避光保存。

3．5×甲醛变性胶加样缓冲液（10ml）。

预先配制水饱和的溴酚蓝溶液：在1.5ml 离心管中加入约0.1mg溴酚蓝，加入1ml DEPC水溶解，充分振荡溶解，离心，可见离心管底部有溴酚蓝粉末剩余，上层液体即水饱和的溴酚蓝溶液。在15ml灭菌离心管中，依次加入以下各种成分：

10 × MOPS缓冲液　　　　　　　4.0ml

甲酰胺　　　　　　　　　　　　3.1ml

100%的甘油　　　　　　　2.0ml

37%的甲醛　　　　　　　　　　 720µl

0.5 mol/L EDTA （pH 8.0）　　　80µl

水饱和的溴酚蓝　　　　　　　　 16µl

DEPC处理水　　　　　　　　　　100µl

混匀，分装，－20℃保存备用，常用放4℃保存。

4．1×甲醛变性胶电泳缓冲液（200 ml），使用时临时配制。

10×MOPS缓冲液　　　　　　　　 20ml

37%的甲醛　　　　　　　　　　 4.0ml

DEPC处理水　　　　　　　　　　176ml

5．已知相对分子质量的RNA标准品（RNA分子量标准，RNA Marker）。

6．仪器设备：电泳仪、水平电泳槽、微波炉、紫外透射仪、凝胶成像分析系统、微量移液器等。

【操作步骤】

【结果分析】 将甲醛变性凝胶置于凝胶成像系统中观察电泳结果、分析结果并拍照。图4-2为总RNA甲醛变性胶电泳图。

图4-2 不同组织、细胞总RNA的甲醛变性胶电泳图

M：RNA Marker；1～6泳道分别是小鼠肾组织、脑组织、胚胎、肺组织以及人肝癌细胞系Huh7细胞、宫颈癌细胞系HeLa细胞的总RNA电泳条带

从图中可看出，28S、18S条带清晰，且肉眼观察28S条带亮度约是18S的2倍。

【注意事项】

1．为避免RNA酶污染，所有试剂均应用DEPC处理水和无RNA酶的玻璃器皿配制。电泳槽必须用3% H2O2 浸泡20 min，然后用DEPC处理水冲洗。玻璃器皿和塑料制品应浸泡在0.1%的DEPC水溶液中，室温过夜，然后用DEPC处理水洗数次。玻璃器皿洗净后180℃烘烤8h，然后高压灭菌15 min，所有塑料制品应用DEPC处理后高压蒸汽灭菌。

2．DEPC是一种强有力的蛋白变性剂，可致癌，操作时应戴手套并在通风橱里进行。

3．甲醛有很强的毒性并易挥发，是一种致癌剂。含有甲醛的溶液应该在通风橱里谨慎处理。

4．含有甲醛的琼脂糖凝胶比非变性的琼脂糖凝胶更缺乏弹性，更易破碎，因此移胶时动作要轻缓。

5．10×MOPS缓冲液要避光保存，溶液见光或高温灭菌后会变黄，变黄的缓冲液不影响使用效果，但变黑时不能再使用。