聚丙烯酰胺凝胶电泳

【实验原理】 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacryamide gel electrophoresis，PAGE）是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂TEMED（N，N，N，N'一四甲基乙二胺）和过硫酸铵的作用下形成的三维网状结构物质。在抑制核酸中碱基配对的变性剂（如尿素、甲酰胺）存在的情况下发生聚合，变性DNA在凝胶中保持单链状态并以线性分子的形式泳动，迁移率与其分子大小的对数成反比，与碱基组成和序列几乎完全无关。聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、＜1kb的DNA片段（尤其对小DNA片段的分析5～500bp）和DNA序列分析，其装载的样品量大，回收DNA纯度高，长度仅相差0.2%（即500bp中的1bp）的核苷酸分子能分离。需根据待分离DNA片段的大小配制适当浓度的丙烯酰胺凝胶（表4-4）。

聚丙烯酰胺凝胶电泳有连续与不连续体系两种：前者指在整个电泳体系中的缓冲液pH 值和凝胶孔径大小相同，主要用于核酸分析；后者主要用于蛋白质样品的分离，它除了电泳槽中的缓冲体系和pH 值与凝胶中不同外，凝胶本身也由缓冲体系、pH 和凝胶孔径不同的两种凝胶堆积而成。不连续体系聚丙烯酰胺凝胶电泳在本书第13章第一节有详细介绍，这里主要介绍连续体系中的DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳。

表4-4 不同浓度丙烯酰胺和DNA的有效分离范围

*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目（bp）

【材料】

1．30%（W/V）的丙烯酰胺储存液（1L），配制如下：

（1）称量下列试剂，置于1L烧杯中。

丙烯酰胺　　　　　　　　290g

双丙烯酰胺　　　　　　　10g

（2）向烧杯中加入约600ml去离子水，充分搅拌溶解。

（3）加去离子水将溶液定容至1L，用0.45μm滤膜过滤，于棕色瓶中4℃保存。

注意：丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴一次性手套。聚丙烯酰胺无毒，但也应该谨慎操作，因为可能含有少量的未聚合成分。

2．10%（W/V）过硫酸铵（10ml），配制如下。

称取1g过硫酸铵，加入10ml去离子水搅拌溶解，4℃储存。

注意：10%过硫酸铵溶液在4℃保存时间为2周左右，过期会失去催化作用。

3．10×TBE电泳缓冲液：临用前稀释10倍。

（1）称量下列试剂，置于1L烧杯中。

Tris　　　　　　　　　　　108g

Na2EDTA·2H2O　　　　　　 7.44g

硼酸　　　　　　　　　　　55g

（2）向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。

（3）加去离子水将溶液定容至1L，室温保存。

4．TEMED（四甲基乙烯基二胺）。

5．仪器设备，如玻璃板、间隔片、垂直电泳槽、烧杯、磁力搅拌棒、微波炉、天平、点样梳、紫外分析仪、微量移液器等。

【操作步骤】

表4-5 各种浓度PAGE胶的配制（DNA电泳用）

【结果分析】

图4-3为DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图4-3 DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳图（见彩图）

A：EB染色法； B：银染法

【注意事项】

1．丙烯酰胺和双丙烯酰胺均为神经毒剂，可经皮肤吸收，其作用具有积累性。称取粉末丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺时，应戴手套和口罩，纯化应在通风橱中进行。

2．勿用手接触灌胶面的玻璃，以防凝胶板和玻璃板剥离，产生气泡和滑胶，或者剥胶时凝胶板断裂，所用器材均应严格清洗。

3．用琼脂糖封底及灌胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过，从而影响DNA条带的形状和迁移方向。

4．从凝胶中取出点样梳后要立即彻底地清洗加样孔，否则梳子所留存的少量丙烯酰胺溶液会在加样孔中聚合，产生不规则表面，引起DNA条带变形。

5．电泳槽中的缓冲液和配制凝胶时的缓冲液务必要同一批次，因为离子强度或pH的微小差别会形成缓冲液前沿，使DNA片段的迁移发生严重的扭曲。

6．凝胶完全凝固后，必须放置30min 左右，使其充分“老化”后，才能轻轻取出样品梳，切勿破坏加样孔底部的平整，以免电泳后区带扭曲。