连接缓冲液的应用

连接反应_分子生物学实验手

利用DNA连接酶把载体DNA和目的DNA片段连接成为一个完整的重组分子，这就是分子克隆中常说的连接反应，也是基因操作实验中最为频繁的操作。当载体DNA和外源DNA末端都是由一种产生黏性末端的内切酶切割产生（同尾酶也可以）的，或者两者末端被接上一段互补的多聚体的尾巴，那么经退火后可形成新的重组分子。连接后产生的重组分子中仍然保留着外源DNA两端的酶切位点，从而使我们能方便地从重组分子中再次取出所克隆的DNA片段。外源DNA片段和线状质粒载体的连接，实质上是在双链DNA 5'磷酸和相邻的3'羟基之间形成新的共价键。在体外这一反应可由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶分别是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。

一、T4 DNA连接酶

T4 DNA连接酶既可催化DNA黏性末端的连接，也能催化DNA平末端的连接。不过，在没有黏性末端的条件下，连接反应更为复杂，速度显著减慢。同样条件下，黏性末端的连接比平末端的连接大约快100倍。

【材料】

（1）DNA样品：溶于H2O或TE缓冲液。

（2）载体DNA。

（3）T4 DNA连接酶（350 U/μl）。

（4）酶储存溶液

Tris-HCl（pH 7.5） 10mmol/L

KCl　　　　　　　　　　　 50mmol/L

DTT　　　　　　　　　　　　1mmol/L

EDTA　　　　　　　　　　 0.1mmol/L

甘油　　　　　　　　　　 　　 50 %

（5）10×T4 DNA 连接酶缓冲液

Tris-HCl（pH 7.6）　　　　 　660mmol/L

MgCl2 　　　　　　　　　 　66mmol/L

DTT　　　　　　　　　　　 100mmol/L

ATP　　　　　　　　　　 　　1mmol/L

（6）3 mol/L乙酸钠（pH 5.2）。

（7）无水乙醇、70%乙醇。

（8）双蒸水。

（9）设备：恒温水浴锅、涡旋振荡器、台式离心机。

【操作步骤】

二、大肠杆菌DNA连接酶

大肠杆菌DNA连接酶可催化相邻DNA链的5'-P末端和3'-OH末端以磷酸二酯键结合的反应，需NAD+作辅酶。往往只能催化黏性末端DNA之间的连接，但如果在PEG及高浓度一价阳离子存在的条件下，也能连接平末端的DNA，但不能催化DNA的5'-P末端与RNA的3'-OH末端以及RNA之间的连接。

【材料】

（1）DNA样品：溶于H2O或TE缓冲液。

（2）载体DNA。

（3）E.coli DNA 连接酶（50～100 U/μl）。

（4）酶储存溶液

磷酸缓冲溶液（pH 7.5）　　　10mmol/L

KCl　　　　　　　　　　　　 50mmol/L

DTT　　　　　　　　　　　　 　1mmol/L

EDTA　　　　　　　　　　　　 1mmol/L

甘油　　　　　　　　　　　　　　 50%

（5）10×E.coli DNA连接酶缓冲液

Tris-HCl（pH 8.0）　　　300mmol/L

MgCl2 　　　　　　　　　40mmol/L

（NH4）2SO4　　　　　　100mmol/L

EDTA　　　　　　　　　 12mmol/L

NAD+　　　　　　　　　　1mmol/L

（6）10×BSA（0.05%）：在－20℃下易产生沉淀，应尽量避免反复多次冻融。短期使用时应在4℃下保存。产生稍许沉淀不影响反应效果。

（7）双蒸水。

（8）设备：恒温水浴锅、涡旋振荡器、台式离心机。

【操作步骤】

三、TA克隆

TA克隆的想法产生于1994年。几位学者发现Taq DNA聚合酶会在PCR产物的3'端加上一个脱氧腺苷（A），而且这种特性与模板无关。之后，Invitrogen公司发明了TA克隆技术，并拥有了全球TA cloning商标的专利权。线性化的T载体在3'端拥有一个脱氧胸苷（T），与PCR产物的A尾巴互补，所以T载体可以非常方便地与PCR产物直接连接，从而大大提高PCR产物的连接、克隆效率。下面以TakaRa的pMD18-T载体为例介绍T载体的连接过程。

【材料】

（1）PCR产物。

（2）pMD18-T载体（TaKaRa）：50 ng/μl（1μl的摩尔数约为0.03pmol）。

（3）溶液Ⅰ（内含T4 DNA连接酶及相应的连接缓冲液）：因含有T4 DNA连接酶，使用前请在冰中融化并轻柔混匀，应尽量避免多次反复冻融。

（4）双蒸水。

（5）设备：恒温水浴锅、涡旋振荡器、台式离心机。

【操作步骤】

【注意事项】

（1）PCR产物中的短片段DNA（甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段）、残存引物等杂质、DNA片段的空间结构、片段的长度等都会影响TA克隆的效率。因此PCR产物尽量进行纯化。一般情况下，大片段DNA的克隆效率小于短片段DNA。

（2）以试剂盒提供的对照插入DNA作为阳性对照进行连接、转化实验。对照插入DNA 1μl （50ng）的摩尔数约为0.15pmol。

（3）本实验操作连接后，直接进行转化时连接液的体积不要超过20μl，大于此体积会降低转化效率。

（4）连接效率偏低时，可适当延长连接时间至数小时。

（5）当进行转化DNA用量较大或准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀纯化DNA后再进行转化。

四、连接反应的影响因素

（一）连接缓冲液的影响

1．Tris-HCl 20～100mmol/L，多为50mmol/L，pH的范围在7.4～7.8，多为7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系。

2．MgCl2 10mmol/L，作用是激活酶反应。

3．DTT 1～20mmol/L，多为10 mmol/L，作用是维持还原性环境，稳定酶活性。

4．BSA 25～50μg/ml，目的是增加蛋白质的浓度，防止蛋白浓度过低造成酶的失活。

（二）pH的影响

pH通常调节到7.4～7.8，较多用7.8。有实验表明，若把pH为7.5～8.0时的酶活力定为100%，那么体系偏碱（pH为8.3）时仅为全部活力的65%；当体系偏酸（pH为6.9）时仅为全部活力的40%。

（三）ATP浓度的影响

ATP是酶反应所必需的，连接酶缓冲液中往往含有0.5～4mmol/L的ATP，现多用1mmol/L。研究发现，ATP的最适浓度为0.5～1mmol/L，过高会抑制反应；当ATP的浓度为0.1mmol/L时，去磷酸载体的自环比例最大。由于ATP极易分解，所以当连接反应失败时，除了DNA与酶的问题外，还应考虑ATP的因素。含有ATP的缓冲液应于－20℃保存，溶化取用后立即放回。连接缓冲液体积较大时最好分小管储存，防止反复冻融引起ATP分解。与限制酶缓冲液不同的是，含ATP的连接缓冲液长期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的缓冲液（可长期保存），临用时加入新配制的ATP母液。

（四）连接温度与时间的影响

黏性末端DNA连接生成的产物双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，但连接酶的最适温度又恰为37℃。为了解决这一矛盾，在经过综合考虑后，传统上将连接温度定为16℃，时间为4～16h。现经实验发现，对于一般的黏性末端来说，20℃反应30min就足以取得相当好的连接效果，当然如果时间充裕的话，20℃反应60min能使连接反应进行得更完全一些。对于平末端是不用考虑氢键问题的，可使用较高的温度，使酶活力得到更好的发挥。

（五）酶浓度的影响

日常使用的DNA浓度比酶单位定义状态低10～20倍，连接平末端时酶用量要比连接黏端大10～100倍。进行黏末端连接时需先行稀释，稀释液的成分与酶保存缓冲液相同或类似，稀释液中的酶能长时间保持活力，也便于随时取用。

（六）DNA浓度和纯度的影响

要得到环化的有效连接产物，DNA浓度不可过高，一般不要超过20nmol/L。要求线性化的连接产物，DNA的浓度可以高些，至少是接近推荐的浓度。在用大质粒载体进行大片段克隆时，以及在双酶切片段的连接反应中，DNA浓度还应降低，甚至DNA的总浓度低至几个nmol/L。另据研究，T4 DNA连接酶对DNA末端的表观Km值为1.5nmol/L，所以，进行连接反应时DNA浓度不应低于1nmol/L，即应具有2nmol/L的终浓度。DNA纯度也影响连接效果，经过苯酚处理/乙醇沉淀纯化的DNA有助于获得理想的结果。