免疫检测方法和技术

免疫检测技术是指利用免疫反应特异性的原理，建立各种检测与分析的技术。常规免疫检测技术主要是用于检测抗原或抗体的体外免疫血清学反应或免疫血清学技术。免疫血清学技术是建立在抗原抗体特异性反应基础上的检测技术。

（一）酶免疫分析方法

酶标记抗体技术是将抗原和抗体的特异性反应与酶的催化作用有机地结合的一种新技术。现已广泛应用于各种抗原和抗体的定性、定量测定。最初的免疫酶测定法，是使酶与抗原或抗体结合，用以检查组织中相应的抗原或抗体的存在。后来发展为将抗原或抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶染色，底物显色用肉眼或分光光度仪判定。这后一种技术就是目前应用最广的酶联免疫吸附试验，即ELISA。

免疫酶技术就是抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种新技术。酶与抗原或抗体相结合后，既不改变抗原或抗体的免疫学反应特性，也不影响酶本身的酶学活性，即在相应而合适的作用底物参与下，使基质水解而显色，或使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型。这种有色产物可用目测或光学显微镜和电子显微镜观察，也可用分光光度仪进行检测。显色反应显示了酶的存在，从而证明发生了相应的免疫反应。因而这是一种特异而敏感的技术，可以在细胞或亚细胞水平示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其定量。

至今，所应用的酶大多是辣根过氧化物酶，其次有碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。每种酶通过与自己的特殊作用底物反应而产生典型的有色沉淀物。

1.标记抗原

（1）全酶标记抗原 用于测定小分子化合物的酶有溶菌酶、苹果酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等，通过双功能交联剂N-羟基丁二酰亚胺酯与抗原共价结合。

（2）辅基标记抗原 预先将葡萄糖氧化酶在酸性条件下水解成葡萄糖氧化酶蛋白和黄素腺嘌呤双核甘酸（FAD）两种成分，它们单独存在时无酶活性，但可组成具有酶活性的葡萄糖氧化酶。试验中，先将FAD标记到抗原分子上，当此标记试剂与抗体结合后，FAD即失去重组能力。

（3）辅酶标记抗原 这是利用偶联酶系统的反复增幅放大作用能检测微量辅酶的特性而建立的一种超敏感方法。

（4）底物标记抗原 大都选用β-半乳糖苷酶的荧光性底物———4-甲基伞形酮基-β-D半乳糖苷（4MUG）标记抗原。

2.标记抗体

（1）标记抗体酶抑制免疫测定法 常用磷脂酶c与IgG抗体分子经水溶性羟化和亚胺共价交联成酶标抗体，底物为SRBC（绵羊红血细胞）壁中的磷脂物质。将待测样品、酶标抗体和SRBC加在一起，当抗原抗体结合后可抑制标记抗体中的酶对SRBC壁中磷脂的水解能力， SRBC则不发生溶解。

（2）酶增强免疫测定法 此法需两种抗体试剂。首先在待测样品中加入少量β-半乳糖苷酶标记的抗体，经抗体、抗原结合后，加入琥珀酰化的带过量负电荷的抗体，与抗原发生第二次结合，使其表面的负电荷大大增强。当加入带正电荷的小分子底物邻硝基半乳糖吡喃苷时，由于静电引力作用，在抗原分子周围形成大量的酶底物结合物，经比浊（355nm）测定，可确定抗原含量。

（3）配对酶双标记系统 配对酶亦称偶联酶，其中一种酶催化底物产生的物质正好是第二种酶的底物。

3.不均相酶免疫试验

不均相酶免疫试验是目前最广泛应用的方法。酶结合物直接与样品中的抗原、半抗原或抗体进行免疫化学反应形成酶免疫复合物，它与游离的酶结合物在物质上或多或少是相同的，因此需将其分离后，再进行酶的活性测定，并计算样品中抗原、半抗原或抗体的含量。

（1）直接法 将所选择的酶通过适当的交联剂，与特异抗体球蛋白，与相应抗原温育，然后用该酶的特殊底物，显示抗原-抗体复合物的存在。

（2）间接法 抗原与相应抗体反应后，用酶标记的抗球蛋白温育，然后用该酶的特殊底物，显示抗原-抗体复合物的存在。

（3）双重抗体法 将抗原的溶液与含特异性抗体的免疫球蛋白致敏载体表面温育，洗去过剩的抗原溶液，然后加入酶标记的特异性抗体球蛋白，这种酶标记的抗体球蛋白吸附到已被致敏的载体表面所结合的抗体上。温育后，洗去过剩的酶标记抗体球蛋白，使用特殊的底物显示复合物的存在。

另外，还有专门检测抗原的标记抗原竞争法和不需要使酶与抗体或抗原交联的不标记抗体酶方法。

（二）荧光抗体技术

某些荧光物质在一定条件下，既能与抗原或抗体结合，又不影响抗原与抗体的特异性结合。用荧光抗原或荧光抗体对待检标本染色后，在荧光显微镜下观察，可看到发出荧光的抗原抗体复合物。作为蛋白质标记用的荧光物质需具备如下条件：① 有与蛋白质分子形成稳定共价键的化学基团，但不形成有害产物；② 荧光效率高，与蛋白质结合的需要量少；③ 结合物在一般条件下稳定，结合后又不影响免疫活性；④ 作为组织学标记，结合物的荧光必须与组织的自发荧光有良好的反衬；⑤ 结合程序简单，能制成直接应用的商品。满足这些要求的荧光物质有硫氰酸荧光素（FITC）、四乙基罗丹明（RB200）和四异甲基罗丹明（TMRITC）等，其中应用最广的是异硫氰酸荧光素。荧光抗体（抗原）染色法有以下几类：

1.直接法 直接滴加2～4个单位的标记抗体于标本区，置试盒中，于37℃染色30min，然后置大量pH7.0～7.2的磷酸缓冲液（PBS）中漂洗15min，干燥，封载即可镜检。

2.双层法 标本先滴加未标记的抗血清，置湿盒内，37℃ 30min。漂洗后，再用标记的抗抗体染色37℃ 30min，漂洗、干燥、封载。

3.夹层法 本法主要用于检测组织中的Ig。标本先用相应的可溶性抗原处理，漂洗后再用与该检Ig有共同特异性标记抗体染色。

4.抗补体染色法 用荧光标记抗补体抗体，即可用以示踪能进行补体结合的任何抗原抗体系统。将已灭活的抗血清与1∶10稀释血清混合，滴加于标本上，37℃ 30～60min，漂洗后，再用抗补体染色37℃ 30min，漂洗、干燥、封载、镜检。

（三）放射免疫技术

放射免疫技术又称放射免疫分析、同位素免疫技术或放射免疫测定法。该法为一种将放射性同位素测量的高度灵敏性、精确性和抗原抗体反应的特异性相结合的体外测定超微量（10－9～10－15g）物质的新技术。广义来说，凡是应用放射性同位素标记的抗原或抗体，通过免疫反应测定的技术，都可称为放射免疫技术。经典的放射免疫技术是标记抗原与未标记抗原竞争有限量的抗体，然后通过测定标记抗原抗体复合物中放射性强度的改变，测定出未标记抗原量。此技术操作简便、迅速、准确可靠，应用范围广，可自动化或用计算机处理，但需一定设备、仪器，对抗原抗体纯度要求较严格。目前常用的放射免疫技术有放射免疫饱和分析法和放射免疫沉淀自显影法。