第三节引物的特异性

第三节　PCR反应体系

PCR的基本反应体系包括：需要扩增的模板（template）、一对寡核苷酸引物、维持pH的反应缓冲系统、一价或二价阳离子、4种三磷酸脱氧核糖核酸（dNTPs）、催化依赖模板的DNA合成的耐热DNA聚合酶以及PCR促进剂等。

一、模板

PCR反应的模板可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA为模板时，要先经过反转录生成cDNA，然后再进行PCR反应。

模板（靶基因）核酸的来源可以很广泛，可以是从培养的细胞或微生物中提取，也可以是从临床组织标本、犯罪现场标本、病理标本和考古标本中提取，无论来源如何，待扩增的核酸模板的量与纯度是PCR成败与否的关键环节之一。因此，需要经过纯化处理以除去DNA聚合酶抑制剂。

传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是溶解细胞膜上的脂类与蛋白质因而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白；SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其他细胞组分，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板的提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNA酶降解RNA。

含有目标靶序列的模板DNA可以以单链或双链的形式加入PCR反应体系中，可以是线性，也可以是环状。线性DNA模板的扩增效率要高于环状DNA，这是因为环状DNA复性太快而影响引物与模板的结合。因此，如果模板是环状质粒，最好先用酶将其切开成线性分子。另外，尽管PCR对模板大小的要求不是十分严格，但是通常小片段DNA的扩增效率要高于大分子。

理论上PCR反应的最佳工作条件是需要目标靶序列的单一拷贝作为模板，然而实际工作中，反应体系中总是存在数千拷贝的模板DNA。在以哺乳动物基因组DNA为模板时，通常每次PCR最多取1μg DNA为模板，但这已经含有多达3×10⁵常染色体基因的拷贝。而对于简单得多的酵母、细菌及质粒基因组，每次反应的模板最大加入量通常分别为10ng、1ng和1pg。

二、引物

通常PCR反应中需要有一对引物，扩增产物就是这一对引物之间的双链DNA片段。PCR扩增产物的大小及相对于模板的位置是由引物限定的，因此，引物的选择关系到PCR的特异性。引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能设计与其互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。当需要同时扩增靶DNA上的多个片段，即多重PCR时，需要在反应体系中加入一对以上的引物。

不同的PCR反应体系，由于模板的组成、待扩增片段的长度及其使用目的的不同，对引物的要求也不同。引物设计应最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能地抑制非特异扩增。设计引物应遵循以下原则。

1.引物长度　引物的长度越长，特异性也就越好，引物过短则会影响PCR的特异性。但是，引物过长会使延伸温度超过耐热DNA聚合酶的最适温度，也会影响产物的特异性。因此，引物的长度应适宜，一般为15～30nt，常用为20nt左右，一对引物中两个引物之间的长度差异应＜3nt。

2.引物扩增跨度　以200～500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

3.引物成分　ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。G＋C含量以40%～60%为宜，G＋C太少扩增效果不佳，G＋C过多易出现非特异条带。不应有连续的3个G或C，尤其在引物的3′端，否则会使引物与核酸的G或C富集区互补从而影响PCR的特异性。另外，两条引物应有相似的Tm值，其差别不应＞5℃。扩增产物与引物间的Tm值差别应＜10℃，以确保PCR循环中的扩增产物有效变性。

4.其他

（1）引物自身不应有反向重复序列或＞3nt的自身互补序列，否则引物内部会出现二级结构而影响其与待增靶序列杂交结合。

（2）两条引物间不应有互补序列，特别是3′端，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。若引物二聚体在PCR反应的早期形成，它们将通过竞争DNA聚合酶、引物及4种单核苷酸从而抑制待增DNA的扩增。通过精心设计引物、应用热启动PCR（hot start PCR）或者降落PCR（touch down PCR）及特制的DNA聚合酶，可以减少引物二聚体的生成。

（3）引物3′端是引发延伸的起点，因此一定要与模板准确配对，特别是最末及倒数第2个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。而且，引物3′末端错配的引发率，不同碱基存在很大差异。当末端为T时，错配的情况下也能使引发链的合成。因此，应尽量避免在引物的3′端的第1个碱基是T。引物3′端最佳碱基的选择应为G和C，因为它们形成的碱基配对比较稳定。引物的3′端应为保守的氨基酸序列，即采用简并密码较少的氨基酸，如Met、Trp，且要避免三联体密码第3个碱基的摆动位置位于引物的3′端。

（4）引物5′端仅限定PCR产物的长度，对扩增特异性影响不大。在与模板结合的长度足够的前提下，引物的5′端可不与模板DNA互补而成游离状态，最多可以游离数十个碱基。因此，引物的5′端可以被修饰，如加入限制性酶切位点；标记生物素、荧光素、地高辛等；引入突变位点及引入其他短序列包括起始密码子、终止密码子等。

5.引物的特异性　引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性，不应有连续8个碱基与待扩增区外序列完全互补。为满足这一点，可以采用计算机进行辅助检索、设计。

引物的设计要依据具体情况考虑多方面的综合因素，应尽量遵循上述原则。现在有许多设计引物的计算机软件，能综合分析优化组合引物的各种参数，对引物设计具有指导作用。

在PCR反应体系中，引物的浓度一般要求每条引物为0.1～0.5μmol，这一引物浓度足以使1kb的DNA片段在PCR反应体系中循环扩增30次。引物浓度过低，则产物量低；引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。非特异性产物和引物二聚体都可以作为PCR反应的底物，与靶序列竞争DNA聚合酶和dNTP，从而抑制靶序列的扩增。

三、耐热DNA聚合酶

耐热DNA聚合酶（thermostable DNA polymerase）能耐受95℃以上的高温而不失活，因而无需在每轮循环中添加新酶；同时它催化的聚合反应的最适温度为70～80℃，此时引物与模板结合的特异性好，故产物的纯度高。现在已发现多种耐热DNA聚合酶，其共同特点是在高温下仍保持一定的酶活性，但各耐热DNA聚合酶的性能尚有一定的差别。目前应用最多的是Taq pol。

（一）Taq DNA聚合酶（Taq pol）

天然的Taq pol是从嗜热水生菌Thermus aquatics YT－1菌株中分离获得的。该菌株在1969年从美国黄石国家公园的温泉中分离出来，能在70～75℃的环境中生长。现已克隆出该酶的基因，全长2499bp，编码相对分子质量为94000、长度为832个氨基酸的蛋白质。

目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶；另一种为大肠埃希菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100μl时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

Taq pol在92.5、95和97.5℃的半衰期分别是130、40和5～6分钟。在PCR反应中，DNA变性时间通常为30～60秒，若总共进行30轮循环累计热变性时间为15～30分钟，此时该酶仍然保持相当高的活性，完全可以保证PCR反应的需要。Taq pol的活性有明显的温度依赖性，催化DNA合成的最适温度为75～80℃，此时延伸速率达150个核苷酸/（秒·酶分子）。

因为Taq pol无3′→5′外切酶活性，所以，它不像Klenow酶一样具有校对功能，在催化PCR扩增过程中，引起碱基错配的概率大大增加。通常，Taq pol在PCR反应出现碱基错配的概率为1/300～1/18000，在经过25轮扩增后，扩增产物的序列中每400bp就有一个与原始序列不同。

Taq pol具有类似脱氧核糖核酸末端转移酶（TdT）的活性，可在新合成的双链产物的3′端加上一个非模板依赖的碱基。在4种dNTP中，该酶对dATP的聚合能力最高。所以，在标准PCR反应条件下，PCR产物的3′端的非模板依赖碱基几乎总是A。利用这一特性，我们可以构建dT－载体来克隆带dA尾的产物。

（二）其他耐热DNA聚合酶

目前，已发现了多种耐热DNA聚合酶，并对它们进行了特性的研究，同时，人们还致力于对现有的耐热DNA聚合酶进行修饰和改造，使其获得更好的性能，从而提高PCR的产量和质量。

1.修饰Taq DNA聚合酶 常见的有重组Taq pol（rTaq pol）和Stoffel片段。重组Taq pol为Letus公司利用基因工程技术在大肠杆菌中表达的Taq pol，其热稳定性比天然Taq pol要好，97.5℃时的半衰期达10分钟。Stoffel片段是Stoffel等人除去Taq pol N端的289个核苷酸得到的一种无5′→3′外切酶活性的61kDa的酶蛋白，热稳定性极佳，97.5℃时半衰期达到了20分钟，比Taq pol延长了2倍多。利用此酶可以提高PCR反应的解链温度，对于扩增GC丰富的模板及具有二级结构的模板极为有利。

2.Pfu DNA聚合酶 Pfu DNA聚合酶是从Pyrococcus furisus菌体中提纯的，该酶具有校正功能，催化DNA合成的忠实性要比Taq pol高12倍。此外，其耐热性也极好，97.5℃的半衰期＞3小时。

3.Vent DNA聚合酶 是New England Biolabs公司从海底火山口98℃水中生长的Litoralis栖热球菌中分离提纯得到的，并在大肠埃希菌中成功地得到了表达。该酶热稳定性极好，97.5℃下的半衰期长达130分钟。此外，还具有校正功能，从而有效地降低碱基错误掺入率，提高扩增的忠实性。其碱基错误掺入率为1/31000，扩增产物的忠实性比Taq pol高5～10倍。

为了进一步提高PCR产物的产量和片段长度以及保真性，可使用高保真DNA聚合酶混合物。典型的酶混合物有Herculase DNA聚合酶，该酶混合物的主要聚合酶是Pfu DNA聚合酶，次要聚合酶是Taq酶，并含添加剂AcegaeMaxx因子。该酶混合物适用于需要高保真、高产量和长片段的扩增，以及富含GC的模板。其余商品化的高保真DNA聚合酶混合物主要是由Taq酶加上少量的纠错DNA聚合酶（如Pfu、DeepVent、Tgo）组成。

四、三磷酸脱氧核苷酸

4种三磷酸脱氧核苷酸（deoxynucleotide triphosphates，dNTPs）为PCR反应的合成原料。dNTPs的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1mol/L NaOH或1mol/L Tris－HCL的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，－20℃冷冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP的浓度应为50～200μmol/L，浓度过低会降低PCR产物的产量。尤其应注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其他几种时（偏高或偏低），就会引起错配。另外，dNTP能与Mg^2＋结合，使游离的Mg^2＋浓度降低。

五、二价阳离子——Mg^2＋

所有的耐热DNA聚合酶的活性都需要二价阳离子（通常是Mg^2＋），Mg^2＋对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200μmol/L时，Mg^2＋浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg^2＋浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

六、反应缓冲系统

PCR反应需要有必需的、合适的酸碱度和某些离子，这些都由反应缓冲系统提供。目前，最常用的缓冲液是10～5mmol/L的Tris－HCl（pH值为8.3～8.8，20℃），在72℃（通常PCR反应延长阶段的温度）时，其pH值为7.2左右，故在实际的PCR反应体系中，其pH值变化为6.8～7.8。

此外，反应缓冲系统中还含有KCl、Taq pol保护剂，如小牛血清白蛋白（100μg/ml）、明胶（0.01%）、Tween－20（0.05%～0.1%）或二硫苏糖醇（DTT，5mmol/L）等。