第三节 激光扫描共聚焦显微镜的样品及其制备
共聚焦显微镜可测定样品的种类很多，其中包括生物材料，组织（切片），细胞（亚细胞）等。
一、组织和细胞样品中荧光的来源
1.自发荧光 组织细胞不经任何荧光染色，便能够在短波长的激发下发射出荧光。很多动植物细胞本身就有荧光。近年来使用的绿色荧光蛋白就具有自发荧光。在荧光测定中，有很多自发荧光会干扰测定。
2.荧光染色 很多荧光探针（或称荧光染料）与组织细胞作用，能够在光的作用下发出特征性的荧光，借以观察组织细胞的形态结构，化学组成和功能。特点是灵敏度高，对细胞损害小可做活体染色。
3.免疫荧光 荧光抗体法产生荧光。
4.外源性荧光物质进入组织细胞内产生荧光 某些药物，如多柔比星（阿霉素）、四环素蓄积于细胞内，可使之带有荧光。
5.诱发荧光 生物胺类物质（如儿茶酚胺）能与某些醛类物质在一定条件下发生缩合反应产生强荧光，称诱发荧光。该法特异性高敏感度高。
6.酶致荧光 某些酶的反应产物能够产生荧光，如脱氢酶反应中，辅酶Ⅰ转变成还原型辅酶Ⅰ后可发出红色荧光。
在荧光分析中，以上6个方面常常作为使样品具有某种荧光的手段。这样通过直接测定物质自身所发的“内源性荧光”或间接测定经荧光探针标记的物质的外源荧光，可以测定细胞地形态学变化、细胞内物质的化学组成和结构性质等的变化。给样品中待测样品赋予某种荧光的操作称为荧光标记。
二、荧光样品的制备要求
对样品进行荧光标记的操作直接决定实验的成败，同时荧光标记的效果又与样品制备的其他环节相联系，因此考察样品制备的是否成功要从总体效果来进行。成功的荧光标记样品应具有以下特征：①荧光标记反应的特异性强，荧光信号定位准确，这一点在标记细胞内分子和亚细胞结构时尤为重要；②保持样品应有的形态结构完整性，其中包括不改变生物样品的反应活性，不干扰其正常的状态，毒副作用小；③荧光信号的响应准确、灵敏，具有可重复性；④荧光强度适宜，如果荧光太弱不易检出，太强会超出监测范围，图像精细结构不清晰，还造成光谱交叉、背景过强、定位不清等干扰；⑤荧光稳定性好；⑥样品内荧光应均匀分布；⑦两种或两种以上的荧光信号之间的荧光光谱交叉可以得到消除；⑧图像背景干净，干扰杂质少。
三、常用的荧光标记方法
（一）免疫荧光标记
在目的蛋白定位、定量研究中可以用针对该蛋白的特异性的抗体来进行标记，对目的蛋白进行标记的方法通常有直接标记和间接标记。直接标记是指带有荧光素的一抗直接与目的蛋白结合进行标记；间接标记是指一抗和目的蛋白结合，然后再用带有荧光素的抗一抗的二抗与一抗结合进行标记。间接标记有信号放大作用但非特异性荧光也会较高。
1.免疫荧光单标记法 是指标记一种蛋白质分子。染色方法如下。
（1）所需材料与试剂：培养在盖玻片上融合到70%～80%的细胞，一抗、荧光标记的二抗、4%多聚甲醛固定液、封闭液、0.01mol/L PBS缓冲液及0.3%Triton X－100－PBS。
（2）染色方法
1）取出培养有细胞的盖玻片PBS清洗2～3次。
2）加0.3%的Triton X－100，37℃作用30分钟。
3）加入4%多聚甲醛室温固定30分钟。
4）正常羊血清封闭，室温30分钟。
5）加一抗孵育，37℃1小时或4℃过夜。
6）0.3%的Triton X－100洗5分钟，0.01mol/L PBS洗5分钟，重复一次。
7）加入荧光标记的二抗37℃作用1小时。
8）0.3%的Triton X－100洗5分钟，0.01mol/L PBS洗5分钟，重复一次，用滤纸吸干。
9）90%甘油（PBS配置）封片。
2.免疫荧光双标记法 是指同时标记细胞内两种蛋白质分子。标记时应注意两种二抗所带荧光素的发射光不应重叠且应尽量远离，通常可以选择FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5，或Cy3和Cy5等组合。染色时通常两种一抗可以同时孵育，然后同时孵育两种二抗。但当染色结果一种颜色非常弱，而另一种颜色比较强时，应考虑先孵育颜色较弱的二抗且延长孵育时间。其他步骤同免疫荧光单标记。此外还有免疫三标记法等，见表9－1。
表9－1 免疫荧光标记法
（二）荧光蛋白的示踪
常用的荧光蛋白是GFP，首先从水母中发现，GFP在蓝光的激发下产生绿色荧光。目前通过对GFP的改建，已有多种发射不同颜色荧光的荧光蛋白，如蓝色荧光蛋白（BFP）、黄色荧光蛋白（YFP）及青色荧光蛋白（CFP）等。BFP融合蛋白和GFP融合蛋白，或GFP融合蛋白和RFP融合蛋白可以双转染细胞，进行多色荧光蛋白的定位。
外源基因与GFP DNA相连，GFP可作为外源基因的报告基因实时监测外源基因的表达。荧光蛋白的出现是一项技术上的革命，它将复杂的生化过程与活细胞内的蛋白质功能连接在一起，可以在活细胞中实时跟踪目标蛋白的分布。主要应用：①对活细胞中的蛋白质进行准确定位和动态观察；②GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞，可动态观察该分泌蛋白分泌到胞外的过程；③荧光蛋白可用于在FRET测量中研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用；④荧光蛋白作为生物传感器，可用来描述信号传导，如PKC激活后，从胞质到核膜的转位；⑤GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因连接后转染，就能显示出细胞中细胞核、内质网、高尔基体和线粒体等细胞器的结构及病理过程；⑥可用于双标或三标。以上这些荧光蛋白的应用全部可以借助激光扫描共聚焦显微镜来实现。
（三）核酸标记方法
检测核酸的前提是需要将核酸用荧光探针标记。荧光探针分子与核酸的结合主要有3种方式：①嵌入性结合方式，即荧光探针分子直接嵌入DNA的两个碱基之间，每隔几个碱基嵌入一个荧光分子，这种结合紧密、稳定；②结构亲和方式，以静电力结合，这种结合极弱，常造成荧光分子的丢失；③以共价键方式结合，该染色方式费时，细胞丢失多，荧光分子丢失多。以下为几种重要的核酸荧光探针。
1.碘化丙啶（PI） 属嵌入性荧光探针，与核酸反应迅速，可以嵌入到双链DNA和RNA碱基对中与之结合，无碱基特异性。PI染色可同时标记出双链DNA和RNA的总和，经RNA酶处理出去双链RNA的干扰后，可定性和定量观察DNA。PI因不能进入完整细胞膜，可用来检测细胞的死活。样品为活细胞时，可直接向活细胞培养液中加入PI，使终浓度为1～15μg/ml，室温染色5～15分钟；样品为固定细胞时，用含有1～10μg/ml的PBS染液，染5～15分钟。
2.Hoechst33342、Hoechst33258和DAPI 这3种都是DNA特异性荧光探针，主要结合在DNA的A－T碱基区。结合后都是以紫外光激发，发射明亮蓝色荧光。当DAPI与双链DNA结合时荧光强度增加20倍，与单链DNA结合时，无荧光增强。这3种探针均可用蒸馏水配成1mg/ml的储存液，使用时用PBS稀释成1μg/ml，室温染色15～30分钟，洗涤后共聚焦显微镜下观察。
3.吖啶橙（AO） 即可标记DNA又可标记RNA，用蓝光激发后能够发出绿、红两种荧光。AO与核酸的结合分为强弱两种方式：①强结合方式，为AO插入到双链核酸的碱基对之间，结合稳定，主要是AO分子与DNA的结合，荧光发射峰为530nm，呈绿色荧光；②弱结合方式，AO分子与核酸分子通过静电吸引结合，主要是AO与RNA分子的结合，发射波长为640nm，呈红色荧光。染色方法：①新鲜细胞涂片或其他标本迅速放入95%乙醇固定10～15分钟，干燥后用1%醋酸酸化30秒；②用0.1mg/ml AO溶液［0.1g AO溶于1LPBS（pH值为4.8）］染色5～10分钟，PBS洗涤1分钟；③用0.1mol/L的氯化钙分化30分钟，水洗，随时在荧光显微镜下观察，直到DNA和RNA显色清晰为止；④再用上述PBS冲洗3次，细胞核的DNA呈现亮绿色或黄绿色荧光，胞质和核仁的RNA呈现橘红色荧光。
（四）细胞内离子标记方法
在实验中有时需要测量活细胞内离子的动态变化，如K＋、Na＋、Ca2＋、Mg2＋、H＋的浓度变化和胞内分布等情况。激光共聚焦显微镜除了能给出被标记物浓度与时间的曲线外，还能准确实时的采集该标记物的分布和强度的二维图像，从而给出被标记物在某特定因素影响下其空间分布随时间变化的时空信息。如果共聚焦显微镜获取图像的速度足够快，甚至能够捕捉被标记物的瞬间变化情况。
不同的离子需要不同的探针进行标记才能在共聚焦显微镜下观察。Ca2＋常用的探针有Fluo－3、Fura Red、Calcium Green－1、Calcium Orange等，这类探针多为Ca2＋螯合剂，不与Ca2＋结合时不发光，通常也不能进入细胞膜，只有与乙酰甲酯（AM）相连方可进入细胞。与AM相连的Ca2＋探针，进入细胞内后AM被胞内酯酶水解，并与细胞内游离Ca2＋结合后发出荧光。Na＋常用的探针为Sodium Green，是唯一Ar2＋激光器可激发的Na＋荧光探针，当与Na＋结合后荧光发射强度增强。H＋常用的探针为BCECF、SNARF－1、SNAFL、HPTS等。以下以Ca2＋的Fluo－3探针为例介绍标记方法：
1.所需材料和试剂
（1）培养在盖玻片上融合到70%～80%的细胞。
（2）Tyrod盐溶液：5mmol/L HEPES，136mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，1mmol/L MgCl2，1.9mmol/L CaCl2，5.6mmol/L葡萄糖，用Tris调pH值至7.4。
（3）Tyrod－BSA：加0.1%的BSA到Tyrod盐溶液中。
（4）Hank盐溶液。
（5）用蔗糖将含BSA和不含BSA的缓冲液的渗透压调至310mOsm/L。
（6）将Fluo－3溶于DMSO至1mmol/L，制成储存液，再溶于Tyrod－BSA或Hank盐溶液中，终浓度为5～15μmol/L。
2.负载方法
（1）将培养在载玻片上的细胞用Tyrod盐溶液或Hank盐溶液洗3次。
（2）取60～100μl Fluo－3滴于盖玻片细胞表面上，用封口膜将液体展平，室温孵育40～60分钟，37℃孵育30分钟（注意保持细胞湿润）。
（3）负载后，细胞用Tyrod－BSA液洗2次，再用Tyrod液洗2次；或直接用Hank盐溶液洗细胞3次。
（4）将负载好的细胞在室温放置15分钟，以使酯酶充分水解。
（五）细胞内细胞器标记方法
一些荧光探针可以直接用于或细胞内某些细胞器和膜的定位，如标记质膜的Di－8－ANEPPS、标记线粒体的Mito Tracker Green、标记内质网的DiOC6（3）、标记高尔基体的NB－DC6－ceramide、标记细胞核的Syto stains等。这些探针可用于和其他功能性探针进行双标记或三标记。例如，DiOC6（3）标记内质网方法：
1.所需材料和试剂 培养在盖玻片上融合到70%～80%的细胞，DiOC6（3）储存液。
2.负载方法
（1）DiOC6（3）储存液的制备：将DiOC6（3）溶于DMSO中，浓度为1mmol/L。
（2）DiOC6（3）工作的制备：HEPES－NaCl缓冲液或Hank液稀释1mmol/L的DiOC6（3）储存液，使终浓度为50nmol/L。
（3）用50nmol/L DiOC6（3）工作液孵育细胞，室温3～5分钟，避光。
（4）负载后用HEPES－NaCl缓冲液或Hank液洗细胞3次。
（方宁涛 潘銮凤）
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