基因治疗的主要步骤

第二节　基因治疗的主要步骤

基因治疗的主要步骤包括：①克隆治疗基因；②选择合适的靶细胞；③通过基因转移系统将治疗基因导入靶细胞；④目的基因在受体细胞内的有效表达。

一、治疗基因

治疗基因的选择来源于人类对疾病分子病理的认识以及基因功能的研究。当选择一个基因作为治疗对象时，必须对基因的序列、结构及其产物的功能等要有详尽的了解。治疗基因可以是与缺陷基因相对应的特定的正常基因，也可以是与缺陷基因无关但有治疗意义的基因，如细胞因子基因等。选择的治疗基因应已被克隆，而且必须置于合适的启动子的控制之下，编码基因的信号肽序列必须完整，只有这样，目的基因才能够完整地、稳定地整合，并能适时适量地表达。目前，已用于临床试验的治疗基因仅集中于少数基因，尤其是对极大部分多基因疾病，如恶性肿瘤、高血压、糖尿病、冠心病、神经退行性疾病的致病基因还有待阐明。这就有赖于人类基因组计划，尤其是功能基因组学的发展。这不仅限于这些致病基因的发现，同时也包括已知和目前尚未知功能的基因的表达调控序列的确定，以及其相互作用规律的阐明。

二、合适的靶细胞

人体中的细胞有两大类：一类是生殖细胞；另一类是体细胞。

体细胞基因治疗的影响只限于某个体的当代，只涉及患者本人体细胞的基因转变，但总有一些种类的细胞是难以实施基因治疗的，并且该种基因治疗不能从根本上解决向后代的传递问题。体细胞基因治疗在技术上易于施行，无伦理学障碍，是目前公开允许进行的基因治疗方式。

生殖细胞基因治疗是将外源的正常基因转移到患者的生殖细胞中，其治疗是矫正了个体的所有细胞，使其后代发育成正常个体并世代传递。理论上讲可以从根本上解决后代的遗传缺陷问题，但目前的技术还远远未能做到避免外源基因的插入引起的生殖细胞基因突变，以至于对生殖细胞的操作很有可能使后代产生另外的缺陷。即使没有医学技术上的问题，很多社会伦理方面的问题目前也很难解决。比如，到底哪些基因可用于治疗？人类是否可以利用遗传工程随心所欲地改造自己？或者说我们是否可以随意“创造”一个个体？这些问题目前都还在争论中。大多数国家和地区对此问题都保持着谨慎态度。

选择靶细胞时最好选择组织特异性细胞，比如目的基因在哪种组织细胞中有表达就选择哪种组织。目前常用的靶细胞主要有以下几种。

1.骨髓细胞，尤其是造血干细胞　骨髓细胞是多种细胞的前体，有较多的遗传病或多或少都涉及源自骨髓的细胞，有可能应用经基因工程改造过的骨髓细胞来治疗一些并不直接与骨髓细胞有关的遗传病。骨髓又是体内重要的造血组织，骨髓内有多种造血细胞处于不同的发育阶段，对于那些与造血组织相关的疾病，可以将治疗基因转移至造血干细胞，则可以使转移基因终生存在于所有造血细胞内。但干细胞含量很少，仅占骨髓细胞的0.1%左右。

2.成纤维细胞，尤其是皮肤成纤维细胞　成纤维细胞具有长期自我更新能力，并且易于进行体外培养和高效转染。通过皮肤活检，很容易得到患者本身的原代皮肤成纤维细胞，当经基因转移的细胞再输回患者体内时可以避免免疫排斥反应。

3.肝细胞　肝脏是重要的代谢器官，许多遗传病都是由于肝脏特异的基因产物缺陷所引起；肝癌又是发病率较高的恶性肿瘤。此外，肝细胞作为移植细胞还可在异位发挥功能。所以，以肝细胞作为受体细胞进行基因治疗是基因研究的热点之一。但肝细胞取材不易。

4.肌细胞　骨骼肌细胞的突出特点是可以进行直接体内基因转移，即将真核表达载体直接注射入骨骼肌。骨骼肌细胞中的成肌细胞，寿命较长适合于长期的外源基因表达，以及来源丰富容易取出和培养，具有一定的分裂功能，因而对反转录病毒载体的感染很敏感，容易移植。成肌细胞中分泌的外源基因表达产物，不仅对骨骼肌组织产生一些生物效应，而且可以进入血液以影响全身。因此，对一些全身性疾病，具有重要的应用价值。

另外，血管平滑肌细胞增殖是许多血管性疾病的重要病理变化，在心血管疾病的治疗中，抑制血管平滑肌细胞的增殖是一个重要的研究领域。在体外实验中，已有将自杀基因和抑癌基因导入血管平滑肌细胞中成功抑制血管壁增厚的报道。血管平滑肌细胞可以进行体外培养，经遗传操作后再送回血管。

5.淋巴细胞　外周血淋巴细胞中的T细胞担负着重要的免疫功能，也很容易从体内取出和回输，可以在体外进行培养和扩增，并对目前常用的几种转移方法都具有一定的敏感度。

6.血管内皮细胞　将基因导入血管内皮细胞，可以直接向血液中分泌基因表达产物。

7.肿瘤细胞　对目前的绝大多数的基因转移方法都比较敏感，特别是肿瘤细胞始终处于旺盛的分裂状态，所以可以进行高效率的转导。

8.其他细胞　许多实质器官的细胞也是基因治疗较为常用的细胞类型，除了肝细胞外，还有心肌细胞、脾细胞。但实质器官细胞的取出要借助外科手术，至少也是活检，移植较为困难。

三、基因转移系统

参见本章第三节。

四、目的基因在受体细胞内的有效表达

基因治疗应以目的基因在受体细胞内的表达水平及其调控近似于体内正常的外环境为目的，也就是说，基因治疗的有效性有赖于目的基因在特定组织、细胞中适时、适当水平的表达，即控制性表达而非随机失控性表达，表达产物才能发挥正确的治疗作用。所以，如何有效地调控外源基因在体内的表达，使其控制在适当水平，是决定基因治疗是否成功的关键。过度的表达不仅对治疗疾病不利，甚至有可能引起致命的毒副反应。

正由于基因表达调控在基因治疗中起重要作用，而目前的技术水平还达不到可以在体内精细调控基因表达，所以首先进行的基因治疗都是选择那些目的基因表达在导入人体后即使不进行精确地调控也能达到较好的基因治疗效果的病种，比如一些单基因遗传病。随着技术的进步，预期总会有一天，许多病种都可以用基因治疗作为治疗手段之一。