限制性内切核酸酶

第一节　限制性内切核酸酶

在DNA重组及核酸杂交等技术中，分子生物学家需利用一些基本的工具酶对DNA和RNA进行操作。例如:对目的基因进行操作时，需限制酶在准确的位置切割，使较大的DNA分子成为一定大小的片段;构建重组DNA分子时，必须在DNA连接酶的催化下，才能使DNA片段与载体共价连接。此外还有一些DNA修饰酶和RNA修饰酶也是进行DNA和RNA操作时所必不可少的，比如DNA聚合酶、逆转录酶、RNA聚合酶、RNA连接酶、末端转移酶、核酸酶及磷酸酶等。本章重点介绍这些酶类的性质及其基本原理和实验方案。

本章共分五部分。第一部分介绍限制性内切核酸酶的功能与特性，酶切的基本方法及影响酶切效率的因素。对每种商品酶的识别序列、反应条件及热灭活条件也进行了较为详细的介绍。

第二部分介绍限制性作图的3种方法。一种是用多种限制酶消化DNA，通过凝胶电泳分析不同的酶切片段，从而推导出完整的DNA图谱。另一种是部分消化法，即首先以某个酶对DNA进行完全消化，再进行部分消化，部分消化的DNA大片段必定等于完全消化中相应部分的两个以上小片段之和，再根据两类消化中片段大小的关系和交错重叠现象，找出各片段的邻近位置，排出它们的顺序。第三种为末端标记法，对在特定区段频繁出现的限制性位点或小片段进行限制作图。

第三部分讨论除限制酶外其他用于DNA和RNA操作的酶类的性质、主要用途、实验方案及反应条件等。这些酶包括:DNA聚合酶，用来催化以双链DNA或带引物的单链DNA为模板的合成反应;连接酶，用来连接双链DNA片段或单链RNA片段;RNA聚合酶，用来催化以双链DNA为模板的RNA合成;磷酸酯酶，用以除去核酸5'端的磷基;激酶，用以磷酸化5'端的羟基。

第四部分是构建重组DNA分子的一般技术。由于这些技术含有大量的专业技巧，这里仅介绍克隆实验的最佳方案及其基本原理。并对某些特例作了较为详细的讨论，如平端或黏性末端片段的亚克隆、定向克隆、非匹配末端的连接及寡核苷酸接头的连接、PCR技术在DNA重组中的应用等。

第五部分讨论非放射性探针的标记和检测方法。生物素和地高辛标记的探针正广泛用于各种杂交反应中，使用这些探针具有相当的稳定性和敏感性，可用比色法或化学发光系统检测。更重要的是可以免除放射性对人体的损害，因而受到广大科技工作者的欢迎，有取代放射性标记探针之势。

一、限制性内切核酸酶的特性

限制性内切核酸酶的特性主要有以下几点。

(1)各种限制性内切核酸酶具有专一的识别与切割序列(见表1-4)。

(2)识别碱基对数目一般为4bp、5bp、6bp长度范围。但亦有识别序列为8bp或8bp以上者，如NstⅠ和SfiⅠ的识别序列为8bp，可将基因组DNA切割为较大DNA片段，对制作真核基因组物理图谱极为有用。

(3)识别序列大多为二重对称(即回文结构)。

(4)多数限制性内切核酸酶的切割位点就在识别位点内，但少数限制酶的切割位点不在识别位点之内，而是在识别位点的旁侧。例如:HgaⅠ的识别位点是GACGC(5/10)，切割位点在两条DNA链上分别在距识别位点5个和10个核苷酸处。

5'－GACGCNNNNN↓NNNNNN－3'

3'－CTGCGNNNNNNNNNN↑N－5'

表1-4　　　　商品化限制酶的识别序列与反应条件

续表

(5)限制性内切核酸酶对底物的切割有两种方式。有些限制性内切核酸酶在二重对称轴处同时切割DNA的两条链，产生带平端的DNA片段，如PuvⅡ酶切后的DNA为平瑞，而大多数酶则在对称轴处的两侧类似的位置切割产生单链的突出DNA黏性末端。如EcoRⅠ切DNA后产生5'-P端的突出黏性末端，而PstⅠ则产生3'-OH端的突出黏性末端。

(6)有些限制性内切核酸酶虽然来源及识别位点不同，但切割DNA后产生相同匹配的黏性末端，这些酶称为同裂酶。如BamHⅠ识别位点为5'－G↓GATCC－3'，与其相匹配的黏性末端的酶就有BclⅠ、BglⅡ、MobⅠ、XboⅠ。

(7)限制性内切核酸酶一般都以Mg²⁺为惟一的辅助因子，并要求有一定的盐离子浓度。

(8)限制性内切核酸酶极易失活，要特别注意酶活力的保存，酶保存缓冲液一般为: 10mmol/L Tris-HCl(pH7.4，缓冲pH)、50～100mmol/L NaCl或KCl(盐离子)、1mmol/L DTT(还原性保持酶活性)、100～200μg/mL BSA(保持蛋白浓度，使酶稳定)、50%甘油(存于－20℃不结冰，结冰反复解冻使酶失活)。

二、限制性内切核酸酶消化DNA的方法

单酶对DNA样品的消化只需要酶和DNA样品放在合适的反应缓冲液中温育，其中DNA和酶的量、缓冲液的离子强度、温育温度和时间都依具体的反应而改变。反应系统如下:

DNA样品　　　　　　 1μL

10×缓冲液　　　　　1μL

限制性内切核酸酶　　1μL

ddH₂O　　　　　　　 7μL

三、影响酶切效率的主要因素

影响酶切反应的因素有很多，主要有DNA的纯度、DNA甲基化程度、缓冲液系统和温度等。

1.DNA纯度

限制酶酶解反应的效率很大程度上取决于DNA的纯度。DNA制品中的污染(如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高盐浓度)均能抑制酶解活性。小量快速提取制备的DNA样品往往存在这种情况。这种抑制可通过增加酶的量(10～20U/μg DNA)，增大反应体积以稀释可能的抑制物或延长反应时间来加以克服。有些DNA样品被DNase污染，因DNase的活性依赖Mg²⁺，所以这样的DNA样品在储存的缓冲液(含EDTA)中是稳定的。但一旦加缓冲液，它们迅速被DNase降解，因此污染了DNase的DNA样品必须重新纯化才能使用。

消化基因组DNA时，加入终浓度为1～2.5mmol/L的多聚阳离子亚精胺可改善酶切效果，其作用是结合带负电的污染物。消化超螺旋或病毒DNA较线状DNA需要更大量的酶(20倍以上)。

2.DNA甲基化程度

大肠杆菌的绝大多数菌株含有两种甲基化酶:dam甲基化酶和dcm甲基化酶。dam甲基化酶可在5'-GATC-3'序列中的腺嘌呤N⁶位置上引入甲基。一些限制性内切核酸酶(PvuⅡ、Bam HⅡⅠ、BglⅡ、XhoⅡ、MboⅠ、Sau 3AⅠ)的识别位点内含有5'－GATC－3'序列。另一些限制性内切核酸酶的识别位点也有一部分含有5'-GATC-3'序列，如ClaⅠ(1/4，4个识别序列位点中有1个含5'－GATC－3')、XbaⅠ(1/16)、TaqⅠ(1/16)、MboⅡ(1/16)和HpbⅠ(1/16)。

原核DNA被MboⅡ消化时受dam甲基化酶的抑制，这在实际应用中并无大碍。因为Sau3AⅠ的识别序列与MboⅡ的完全相同，但其作用不受dam甲基化酶的影响(注:哺乳动物DNA不会在腺嘌呤的N⁶位置上发生甲基化，因此，MboⅡ和Sau 3AⅠ均能有效地使用)。但是，当需要在ClaⅠ、XbaⅠ、TaqⅠ、MboⅡ及HpaⅠ的每一个位点处切割原核DNA或用BcⅡ酶完全消化原核DNA时，必须从dam－的大肠杆菌提取DNA。

dcm甲基化酶能在序列5'－CCAGG－3'或5'－CCTGG－3'中的胞嘧啶C⁵位置上引入甲基。受dcm甲基化酶影响的酶是EcoRⅡ。大多数情况下，用BstNⅠ可避免这一影响。BstNⅠ识别序列与EcoRⅡ相同(尽管它在识别序列内的另一位置切割DNA)，如果不能用BstNⅠ代替EcoRⅡ，那么DNA必须从大肠杆菌dcm－菌株中制备。其他某些酶识别序列可能与经过修饰的dcm甲基化酶识别序列部分重叠。

哺乳动物DNA偶尔含5－甲基化嘧啶，通常在鸟嘌呤残基的5'侧。DNA甲基化的程度与细胞类型有关。真核DNA甲基化方式可用甲基化敏感性不同的同裂酶进行研究。例如，MspⅠ和HpaⅡ的酶切位点都是C↓CGG，当CCGG序列内部的胞嘧啶甲基化时，MspⅠ可切割而HpaⅡ则不能切割，原因是HpaⅡ对这种甲基化非常敏感。有时，限制酶对甲基化的核苷酸序列失去切割能力是一种好事。甲基化酶的识别序列与相伴的限制酶的识别序列接近，当用合成的接头修饰DNA片段的末端时，先将DNA片段甲基化，保护其内部的限制酶切位点，再用限制酶切割接头。

3.缓冲液条件

典型的限制酶缓冲液成分包括:MgCl₂、NaCl/KC1、Tris-HCl、2-巯基乙醇(2-ME)或二硫苏糖醇(DTT)和牛血清白蛋白(BSA)。二价阳离子(一般为Mg²⁺)对于酶切是必需的;Tris-HCl对维持适当的pH值是需要的;巯基试剂可稳定限制酶，但也可稳定潜在的污染物。有些酶类对Na⁺和K⁺浓度敏感，而有些酶在较高的离子强度范围内仍然有活性。

每种限制酶均有其最佳缓冲液，许多酶在几种缓冲液中均能保留大部分活性。许多厂商为每种限制酶推荐4种缓冲液，这些缓冲液在购买酶时由厂商提供，也可单独购买或者实验室自配制10×酶切缓冲液，于－20℃储存可达一年以上。

各厂商推荐的缓冲体系不完全相同。我们建议购买哪家公司的酶就使用该公司与此配套的缓冲液。

除上述4种缓冲体系外，许多实验室用谷氨酸钾缓冲液或乙酸钾缓冲液消化DNA。这些缓冲液的主要特点是用谷氨酸钾或乙酸钾替代NaCl，用Tris-乙酸取代Tris-HCl。虽然有些酶在这些缓冲液中活性较低(有时仅20%)，但多数限制酶在这些缓冲液中具有活性。几种DNA修饰酶在这些缓冲液中也具有活性，如T₄DNA聚合酶和T₄DNA连接酶。上述“通用”缓冲液在多种限制酶消化DNA时是有用的，尤其是当几种限制酶在任何一个标准缓冲液中都不相匹配时，通用缓冲液特别有用。

在非适当反应条件下，如盐离子强度低、高浓度酶、高甘油浓度、高pH值或用Mn²⁺替换Mg²⁺时，有些限制酶特异性降低，通常在识别序列之外发生切割反应。