实验三 感受态细菌的制备及转化
一、实验目的
要求学生掌握分子生物学实验中两种细菌转化的原理，以及CaCl2法转化和电穿孔法转化感受态细胞的制备，外源质粒DNA转入感受态细胞以及转化子筛选的方法。了解细菌转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。
二、实验原理
CaCl2转化法原理:许多细菌(如大肠杆菌)不能摄取有功能活性的DNA，但可以通过人工的方法导入DNA，用CaCl2处理受体菌(本实验用E.coli DH5α作为受体菌)，可诱导短暂的“感受态”，使之具有摄取外源DNA的能力，从而能摄取不同来源的DNA。DNA与Ca2+结合亦可形成对DNase有抗性的复合物，并结合在细菌表面，经过短暂的42℃热激可促进细菌摄取DNA-Ca2+复合物，提高转化效率。然而即使在最佳条件下，也只能将部分质粒DNA导入受体菌。为鉴定这些转化子，需利用质粒的筛选标记。这些标记赋予细菌以新的表型，使转化成功的细菌很容易被筛选出来。如pUC19质粒带有氨苄青霉素抗性基因(ampicillin resistance gene)，以其转化的E.coli DH5α就能够在含氨苄青霉素的选择培养基上生长，未转化的受体菌则不能在这种选择培养基上生长。
电穿孔高效转化法原理:利用高电势差的作用，使感受态细胞表面受损，产生微小的“孔”，然后外源质粒DNA分子通过此“孔”进入细胞内，从而实现转化，使宿主细胞产生新的表型。与CaCl2相比，电穿孔法的转化效率较高。
三、实验仪器、材料与主要试剂
1.仪器
恒温摇床，生化培养箱，水浴锅，超净工作台，分光光度计，全自动灭菌锅，台式离心机，电转化仪，微量移液器，离心管，Epperdorf管。
2.材料
大肠杆菌单菌落，pUC18质粒。
3.试剂
SOC培养基，LB和LA培养基，CaCl2溶液(0.1mol/L CaCl2，10%甘油，ampicillin溶液(100mg/mL)(使用终浓度1000μg/mL)。
四、实验步骤
1.CaCl2转化法
(1)接种一个大肠杆菌的单菌落于50mL LB培养液中，于220r/min摇床中37℃培养过夜。
(2)在一个2L的三角瓶中加入400mL LB培养液中，再加入4mL培养液，于37℃摇床(220r/min)过夜培养至OD600=0.5～0.7。
(3)将培养液分别转至8个50mL预冷无菌的聚丙烯管中，于冰上放置10min，然后于4℃下，4000r/min离心5min，弃上清液。
(4)细胞沉淀用10mL冰冷的CaCl2溶液重悬，于4℃，以4000r/min离心5min，弃上清液。
(5)细胞沉淀用10mL冰冷的CaCl2溶液重悬，冰上放置30min，于4℃，4000r/min离心5min，弃上清液。
(6)用2mL冰冷的CaCl2溶液重悬各管细胞，然后按每管250μL的量分装于预冷的无菌聚丙烯管中，立即冻存于－70℃。
(7)按照以下各步骤使用感受态细菌。
①取体积相当10ng的pUC18与100μL感受态DH5α混匀，已知质粒用无菌水和同时做正对照和负对照，方法如上。
②冰浴30min，42℃热激60～120s，再加入400μL LB并置于37℃振荡培养45min，然后再按照梯度涂ampicillin抗性LA平板。
2.电穿孔高效转化法
(1)DH5α在LA平板上画线，37℃培养12小时
(2)从平板上挑取单菌落，接入装有5mL SOC培养基的universal瓶中，37℃摇床培养12小时(220r/m)
(3)按1∶100的比例将菌液转接入4个250mL SOC培养基中。37℃摇床培养(220r/m)。
(4)当OD值达到0.7～0.8时，将菌液取出，用250mL的离心管4℃7000r/m离心5min。
(5)用去离子水清洗菌体。在vortex上用残余的液体把沉淀打散，加入50～100mL的去离子水，在vortex上剧烈震荡，直至菌液均匀。离心，条件同上。
(6)重复步骤5。弃上清液，用10%Glycerol清洗菌体，在vortex上用残余的液体把沉淀打散，加入50～100mL的10%Glycerol，在vortex上剧烈震荡，直至菌液均匀。离心，条件同上。
(7)重复步骤6，2次。
(8)测试。取20μL菌液进行电转，要求无电火花。
(9)将菌液装入预冷的0.5mL Ep管中，每管40μL。
(10)－70℃保存。
(11)将一定量的pUC18与40μL的感受态混匀，移入电转化杯中，于电转化仪中转化，然后立即加入冰冷的LB，置于37℃预培养30～60min。
(12)按照步骤11，同时做一正对照和负对照。
(13)按照梯度，涂含ampicillin的LA平板，待菌液吸干后，置于37℃培养箱中培养。
五、实验结果
计转化子的数量，从而算出转化频率，与CaCl2转化法做对比。
转化率=转化子的个数/质粒DNA的量(ng)
六、注意事项
感受态细胞转化频率的高低与菌体的生长状况联系紧密，对数生长期的菌体制备的感受态细胞，相对而言，转化频率较高。
CaCl2转化法时热激的时间与温度很重要，一般温度为42℃，时间不能超过120秒。
转化对细胞来说是一个破损过程，所以预培养有利于转化频率的提高。
电转化时，细胞一定要充分洗涤，感受态制备完后，应做空转实验，以便补救。
七、思考题
1.CaCl2转化与电穿孔法转化的原理，导致二者转化频率差异的原因是什么?
2.转化子筛选的原理是什么?
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
