单个噬菌体的分离

实验六　单个M13噬菌体的分离

一、实验目的

了解M13噬菌体载体结构、特征及用途，学习单个M13噬菌体的分离。从M13噬菌体载体中制备单链噬菌体DNA和M13噬菌体双链复制型DNA的方法。

二、实验原理

一个M13噬菌体的病毒颗粒感染一个细菌后形成一个噬菌斑。从感染细菌释放出来的子代病毒颗粒感染邻近细菌，后者又可释放下一代病毒颗粒;如果细菌在半固体培养基(加琼脂或琼脂糖)上生长，子代病毒颗粒的扩散受到一定限制，诸如M13等丝状噬菌体，并可以不杀死感染的细菌，但却使感染细菌的生长速度约降低至原来的1/2;在此情况下，在琼脂糖覆盖层内生长的细菌形成较为混浊的背景。相对这一背景，由生长缓慢的细菌形成了一个不断扩大的环带，最后形成肉眼可见的噬菌斑。

为保证噬菌体种的同源性，首先通过原始培养原种的连续稀释铺板来得到单个感染细胞或单个噬菌斑。

三、实验材料与主要试剂

1.材料

M13衍生质粒感染的大肠杆菌(如M13mp18感染的JM101)。

2.试剂

2×TY培养基、20mg/mL IPTG水溶液(分装储存)。

四、实验步骤

1.将感染菌株或噬菌体原种用2×TY的培养基按1∶10做系列稀释。取稀释液100μL分别放入5mL带盖的试管，做好标记。

载体常储存在感染的宿主中，－80℃，20%甘油保存。载体也能以分离的DNA或噬菌体形式储存。DNA经转染导入细胞;噬菌体则可直接感染细菌，如以下步骤2～5所述。如果载体含有质粒起始点和药物抗性标记，含载体的细胞就能在有抗生素的培养基上分离出单个克隆。如果载体形成活性空斑，以画线的方式可将含载体细胞通过空斑中央的感染细胞块分离单个克隆。

下面步骤假设载体是M13mp载体，含有一编码β-半乳糖苷酶α片段的DNA。这些载体在含β-半乳糖苷酶ω片段的细胞中可产生蓝色空斑。在多克隆位点中插入DNA可使编码α片段的基因失活，这样载体产生的将是无色的空斑。

2.每支试管加入:200μL生长至饱和的非感染细胞，10μL IPTG，4μL/Xgal，3mL45℃顶层琼脂糖(可预先大批准备这3种试剂，这样用起来很方便)。

3.颠倒试管两次，快速混匀，加至单个预温的37℃底层平皿上。

4.让上层琼脂在室温下固化10min，转移至37℃培养箱。

5.过夜生长后，仅保存空斑少于100个的平皿。

需注意的问题:①根据噬菌斑的颜色来鉴别重组体是一种行之有效但并非万无一失的方法。尽管非重组噬菌体总是形成蓝斑，但并非所有蓝斑都必须由非重组噬菌体产生。例如，重组噬菌体所携带的外源DNA区段较小而又不改变lacZ序列的阅读框时，就会编码出一种融合蛋白，这种融合蛋白仍具备参与α互补的部分能力。这种重组噬菌体至少要在培养6h后才出现颜色，并最终形成淡蓝色噬菌斑。曾有一例报道，某一重组噬菌体可产生一种新的α供体蛋白，它的头几个氨基酸由外源DNA的3'端所编码，而其余部分则来自载体中原有的α供体蛋白，这种重组体形成的蓝色噬菌斑无异于未经取代的载体所形成的蓝色噬菌斑。②基本培养基(M9)的琼脂平板可用做M13噬菌体的噬菌斑的形成，其优点是只允许带F^'因子的细菌生长。从这种培养基的平板挑取噬菌斑，感染细菌后所得的培养液中不会含有大量的雌性细菌。而在丰富培养基(2×TY或LB)上形成的噬菌斑则截然不同，含有相当一部分营养缺陷型雌性细菌，这些细菌不被M13噬菌体感染。若在有限时间内用丰富培养基进行培养，F'因子自动丢失的频率尚不会太高，不致引起麻烦。由于噬菌体在丰富培养基上形成过快，我们主张M13噬菌体常规平板培养还是用TY或LB培养基为好。

五、实验结果

平板上形成的白色空斑应初步确定为阳性克隆。

六、思考题

1.基本培养基(M9)的琼脂平板可用于M13噬菌体的噬菌斑的形成，为什么?

2.何为β-半乳糖苷酶的α互补?