利用分子生物学技术鉴定细菌

实验二十一　利用分子生物学技术鉴定细菌

一、实验原理

16S rDNA是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16S rRNA)的基因，长度约为1.5kb，其序列包含10个可变区(variable region)和与之相同的11个恒定区(constant region)。可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关。16S rDNA是细菌系统分类研究中最有用和最常用的分子钟，越来越多的细菌依据16S rDNA被正确分类或重新分类，尤其是许多环境中的细菌。16S rDNA的保守性使应用单一方法进行细菌的统一检测成为可能，尤其在苛养菌及生长缓慢的菌种的检测中具有十分明显的优势。

二、实验设计

1.提取基因组DNA，调整到合适浓度作为模板，PCR扩增特异基因参考本实验附录。

2.合成16S rDNA特异引物:

Primer1:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3';

Primer2:5'-T AAGGAGGTGATCCAAC-3'

3.将PCR产物电泳分离，切下特异带，进行胶回收纯化，参照实验五。

4.将纯化的DNA与T载体连接，不同组可进行不同DNA与T-载体比例的连接，参照实验六。

5.制备大肠杆菌感受态细胞，参照实验七。

6.重组质粒的转化、蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定，参照实验八。

7.序列测定与同源性比较:经测序后所获序列用BLAST软件与GenBank数据库中的16S rDNA基因序列进行同源性比较。

8.应用RPD或CLUSTALW等软件构建系统树，并确定待测细菌的分类地位。

三、结果分析

1.利用16S rDNA可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定，和其他方法相比，16S rDNA序列测定分析更适用于确定属及属以上分类单位的亲缘关系。

2.16S rDNA的数据库信息及分析软件如下:

RDP(http//rdp．cme．msu．edu/html/)

CLUSTALW(ftp://ftp-igbmc．u-strasbg．fr/pub/ClustalW)

ARB(http://www．ard-home．de/)

ORS(http://soul．mikro．biologie．tu-muenchen．de/ORS/)

OPD(http://www．com．msu．edu/OPD/)

各分析软件因采用的算法(algorithm)不同而各有所长。

附细菌基因组DNA提取方法

1.实验试剂

(1)STE溶液:0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)。

(2)1％SDS溶液:取1mL的1mol/L NaOH和0.5mol/L SDS，另加3.5mL的蒸馏水。

(3)TE缓冲液:10mmol/L　Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA。

(4)苯酚/氯仿:按苯酚与氯仿=25∶24的比例混合饱和苯酚与氯仿。

(5)50μg/mL RNaseA:10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，15mmol/L NaCl，在100℃保温15min，然后温室条件下缓慢冷却。

2.实验仪器

培养箱，灭菌锅，超净工作台，低温高速离心机，台式高速离心机，微量移液器，真空干燥器，恒温水浴锅，恒温摇床，50mL离心管(有盖)及5mL离心管，冰箱，小试管，Eppendorf管，Eppendorf管架，吸头，吸头盒，旋转混合器，微型台式真空泵，陶瓷研钵，弯成钩状的小玻棒等。

3.实验步骤

(1)从平板培养基上挑选单菌种接种至5mL的液体LB培养基中，适当温度(37℃)条件下，振荡培养过夜。

(2)取1.5mL的培养液于Eppendorf管中，8000rpm离心5min，尽可能弃去上清液。

(3)向沉淀物中加入3mL STE，重新悬浮沉淀，8000rpm离心5min。

(4)去上清液，将沉淀溶入0.6mL TE中，制成悬浮液。

(5)向样品管中加入65μL10％SDS，剧烈震荡。

(6)将样品管放入65℃水浴中5～8min，溶液变澄清。

(7)加等体积苯酚/氯仿溶液，抽提三次。

(8)取上清液，向上清液中加1/10体积3mol/L的NaAC(pH5.2)。

(9)加等体积异丙醇沉淀DNA，用玻璃棒小心地挑出DNA。

(10)用70％乙醇洗一次，自然干后，加80μL TE溶解。

(11)－20℃保存。