用单层组织培养法培养家蚕的各种组织

用单层组织培养法培养家蚕的各种组织

■　刘年翠　谢天恩　高尚荫

为了研究家蚕脓病的防治问题，必须将脓病病毒接种到家蚕的身体中，因此利用组织培养法使家蚕的组织在体外生长，可以解决下面两个问题：(一)家蚕的饲养在武汉地区只能限于春季，如能用细胞传代法将家蚕各种组织细胞在体外生长及传代，则可将病毒接种到组织上，终年可做实验。(二)可在组织培养上筛选抗脓病病毒物质。

关于家蚕组织的培养，1935年Trager曾用悬滴法培养家蚕的各种组织，结果除卵巢外，其余的组织如神经、脂肪、丝囊、腿或翅芽以及睾丸都不能生长。我们采用单层组织培养法，将家蚕的各种组织培养成功，并曾将脓病病毒接种在各种组织的单层细胞上。现将所采用的方法及结果初步报告如下：

血清的采取：采血前先将健康的第五龄蚕儿浸没于1∶1000 HgCl₂溶液中30～45分钟，再用无菌蒸馏水浸洗三次，每次10分钟，这样消毒以后，蚕儿仍能正常生长。取血清时首先从蚕儿的第三、四腹节上的脚采血，用小解剖剪刀将脚的中间部位剪去；若剪脚的基部，则内脏溢出，影响血流，且易污染，若剪脚尖，则所得血清量稀少。血液自所剪的脚下流出，盛于无菌离心管中，以每分钟2500～3000转离心沉淀10～15分钟，除去血中的细胞。用无菌吸管吸取上层血清注于无菌试管中，加盖橡皮塞，置4℃冰箱中保存备用。也可以从尾角取备，但血液流出缓慢，且量较少。采血操作愈快愈好，防止其氧化变黑。

单层细胞的制备：实验必须用严格的无菌步骤，一切的操作都在无菌室中进行。将健康的第五龄蚕儿浸没于1∶1000 HgCl₂溶液中消毒，方法如上所述，但所用的蚕儿必须在实验前饥饿24～36小时，使其消化道内食料几乎没有残留，以免解剖时食道破裂而污染其他组织。将消毒的蚕儿置于无菌平板上，事前在平板中铺二层纱布，吸干蚕儿体上的水分，便于解剖。用左手固定蚕身，背部朝上，再用细小解剖剪刀先剪去背部的尾角，从尾角处向头部方向沿背部中线直到腹节的第三、四节，小心勿使食道破裂。用无菌镊子取下气管、皮肤、肌肉、食道、脂肪、丝囊、卵巢及睾丸等，分别置于盛有Trager液的小平板中。作为采丝囊的蚕儿必须年幼，因其丝囊还很小而其中丝汁不多(二龄蚕儿较好)，如用五龄蚕儿，则丝囊的丝汁太多，不宜用作组织培养的材料。采取食道后必须先在无菌蒸馏水中洗涤数次去其内部残余的桑叶，用1∶1000 HgCl₂溶液浸半小时，再以无菌蒸馏水浸洗三四次。将各种组织分别置于小试管中，用解剖小剪刀剪碎，直至几无可见的小块为止。加Trager液于各种剪碎组织中，用滴管连续不断地吸出吸入历20次，使单细胞脱离组织块而悬浮于Trager液中，将试管静置于试管架上10～15分钟，小碎块沉降于管底，而单细胞则浮悬于此上层液中。

单细胞的培养及观察：所有的培养液包含有Trager液9份、蚕血清1份，每毫升中青霉素100单位、链霉素100 mg。

克氏瓶(Carrel flask)培养法：分别用无菌吸管吸取上述的各种组织单细胞浮悬液0.5 ml，注入直径3.5 cm的克氏瓶中，并于各克氏瓶中加入培养液1.5 ml，加盖棉塞或橡皮塞，顺时针方向缓慢摇荡，充分混匀，但避免产生气泡，置28℃恒温箱中孵育。24小时后各种组织细胞即开始生长，48小时后可见各种组织细胞数目逐渐增加于瓶底，60小时及84小时后，即长成一层紧密、均匀而像薄纸似的细胞层。以卵巢细胞生长得最好，肌肉、睾丸次之，皮肤、气管再次之，食道和丝囊有的在实验室中生长，但有的则不生长。

平板盖玻片法：先将18 mm×18 mm的盖玻片两块置于直径5 cm的平板内一同灭菌，吸取上述带有单细胞的各种组织细胞的悬浮液0.25 ml于每片盖玻片上摇荡，使之铺满全盖玻片，再加Trager培养液5 ml，将平板盖好置28℃恒温箱中，48小时后用肉眼观察细胞在盖玻片上长成一薄层，且蔓延到平板上，如将盖玻片取出，在显微镜下观察，可见单细胞紧密平铺在盖玻片上。但有的细胞之间有空隙，有些细胞彼此重叠。产生空隙的原因，多为原来接种细胞在那区域内数目不足，所以细胞生长分裂后还有空隙。细胞彼此重叠的原因是在悬浮液中除单细胞外，还有两三个细胞连成的小块生长繁殖后所致。利用此法可在显微镜下：(1)观察单细胞层的生长情况；(2)接种病毒后观察多角体的形成及细胞病变现象。

试管盖玻片法：此法与平板盖玻片法大致相同，所不同处在于利用Pyrex试管附盖玻片代替平板，作斜面培养。操作步骤、用途及结果与平板盖玻片相同。

曾试验过于Trager液中不加任何血清，结果各种组织的细胞生长不良。也曾于Trager液中加羊血清，但各种组织细胞不能于其中生长。

曾于各种组织单层细胞上接种过脓病病毒，试观察多角体的形成，其详细结构将于以后报告。

(1958年1月22日)