血凝素基因的扩增

实验四　血凝素基因的扩增

一、实验目的

掌握用RT-PCR法扩增病毒基因的方法。

二、实验原理

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)可用来扩增位于两段已知序列之间的DNA片段。

如图4-1所示，在由DNA聚合酶催化的一系列合成反应中，使用了两段寡核苷酸作为反应的引物。在一般情况下，这两段寡核苷酸引物的序列互不相同，并分别与模板DNA两条链上的各一段序列互补，并且这两段模板序列又分别位于待扩增DNA区段的两侧。

反应时，首先在两段寡核苷酸以及4种dNTP参与下对模板DNA进行加热变性。随后，将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火。此后退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。如此反复进行变性、退火和DNA合成这一循环。由于一轮扩增的产物可充当下一轮扩增的模扳，所以在这一周而复始的过程中每完成一个循环，就可使目的DNA产物增加1倍。

PCR扩增技术在医学与生物学有如下用途:

(1)遗传性疾病的检测;

(2)遗传学鉴定;

图4-1　聚合酶链式反应示意图

(3)基因突变位点的分析;

(4)通过选择性扩增特定DNA区段，生成特异性探针;

(5)由少量mRNA生成cDNA文库;

(6)染色体位移(chromosome crawling)。

三、实验材料及器械

(1)逆转录酶及其缓冲液、Taq酶及其缓冲液、dNTP、引物、无菌ddH₂O。

(2)病毒RNA。

(3)tip头、Eppendorf管、PCR仪、水浴锅、微量加样器。

四、实验步骤

1.逆转录

在冰上按顺序加入以下试剂:

无RNase ddH2O　　　　　　　　　　　　　定容至5μl

RNA样品　　　　　　　　　　　　　　　　0.05～1μg

逆转录Primer(或者随机6聚体引物)　　　　　　　1μl

总体积为　　　　　　　　　　　　　　　　　　　5μl

(2)将以上试剂混匀，在72℃下保温2min，立即置冰浴2min。

(3)在冰上按顺序继续加入以下试剂:

5×第一链反应缓冲液　　　　　　　　　　　　　　　　　　2μl

DTT (20mmol/L)　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1μl

dNTP (10mmol/L each)　　　　　　　　　　　　　　　　　1μl

SuperScriptTMⅡReverse Transcriptase　　1μl(200unit/μl)

(4)混匀，在42℃下保温约1h，置于冰上终止第一链合成反应，即得cDNA样品。94℃5min以灭活逆转录酶。－20℃保存备用。

2.PCR

在冰上按顺序加入以下试剂进行PCR反应:

无核酶ddH2O 　　　　　　　　　　　　　80μl

10×cDNA PCR缓冲液　　　　　　　　　 10μl

dNTP mix (10mmol/L each)　　　　　　　2μl

primer 1 and2　　　　　　　　　　　　　4μl

cDNA样品　　　　　　　　　　　　　　　 2μl

混匀，按以下程序进行PCR反应。

94℃5min;

94℃30s，50℃60s，72℃30s，30个循环;

72℃延伸5min。

取10μlPCR产物并加入2μl6×上样缓冲液于1.0%琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察并照相记录(图4-2，电泳后可在紫外灯下可见一条约1.7kb的条带)。

图4-2　HA PCR结果

五、方法评注

1.背景介绍

多聚酶链式反应1971年由Khorana等首先提出，他们认为可在体外经DNA变性，与适当引物杂交，再用DNA聚合酶延伸，克隆DNA。但该技术最终则是由美国Cetus公司人类遗传研究室的年轻科学家Kary B.Mullis于1985年发明，这一技术在很短的时间里即风行全球，形成了分子生物学领域的热潮，诸多科学家期望凭借这一工具来提高研究水平，解决所面临的一些难题。Mullis因其杰出的贡献，1993年获诺贝尔化学奖。

Mullis最初建立的PCR方法使用三种温度的水浴进行实验，用大肠杆菌DNA聚合酶I的KLENOW片段催化复性引物的延伸，但该酶不能耐受高温，所以每一轮反应都需要添加新的酶，产量不高且操作繁复，对实验操作要求较高，无法推广使用。

1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶(Taq)引入了PCR技术。该技术才得到真正的应用。Saiki等利用PCR方法扩增人珠蛋白DNA，并用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。现在PCR技术以其高特异性、高敏感性及简便快捷使其成为基因诊断首选的技术之一。但PCR技术用于诊断也存在着明显的缺陷，理论上能将量极微的(fg DNA)目的基因在较短的时间内(1～2h)扩增到极易检测的微克水平。PCR经30～35个循环，扩增倍数一般可达百万倍。因此，PCR技术很容易出现污染而导致假阳性结果。

PCR技术问世以来正以惊人的速度发展，许多新型的PCR技术或由PCR衍生的新技术正不断出现，如转录依赖的扩增系统(TAS)、循环探针反应、链替代扩增(SDA)等。

2.技术要点

(1)PCR各组分的配制与加样量:

①引物浓度与引物的配制:

引物浓度:一般为10pmol，浓度太高会导致非特异扩增片段增多，浓度太低则扩增效率降低。

引物配制:厂家提供的引物一般是干粉状态并标明OD值，1 OD约含33μg。一般配置时稀释至10pmol/μl。

Oligo DNA中的每个脱氧核苷酸碱基的平均分子量近似为324.5U，则一条Oligo DNA的分子量=碱基数×324.5U。

例:您得到一管标为5 OD₂₆₀的20 mer Oligo DNA

分子量=20×324.5 =6490U

质量数=5×33 =165μg

摩尔数=165/6490 =0.025μmol =25nmol

②模板DNA:浓度不可过高，20ng。

③Taq DNA聚合酶:一般用量1U/20μl反应体系。

(2)扩增轮数与退火温度

扩增轮数:一般30～40轮，30轮就可使模板扩增10⁶倍。

退火温度快速计算公式:Tm值= (GC×4+AT×2)－5