实验六 血凝素基因的连接
一、实验目的
掌握DNA片段连接的方法。
二、实验原理
DNA分子的体外连接就是在一定条件下，由DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻的5'端磷酸与3'端羟基之间形成磷酸二酯键的生物化学过程，相邻的5'磷酸和3'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。连接反应的目的是将外源DNA片段插入载体中，实现连接。
本实验选用T4噬菌体DNA连接酶。T4 DNA连接酶为一分子量为68000U的多肽，既能催化粘端连接，也能催化平端连接，且不受dNTP抑制。
三、实验材料及器械
(1)外源DNA片段、T载体。
(2)T4 DNA连接酶、10×连接缓冲液、H2O。
(3)水浴锅、tip头、Eppendorf管、微量加样器。
四、实验步骤
病毒血凝素基因DNA片段的连接
外源DNA片段 2μl
T载体DNA +2μl
T4DNA连接酶 1μl
10×连接缓冲液 1μl
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H2O 4μl
总体积 10μl
16℃反应过夜( 16h) ，连接产物转化E.coli 感受态细胞。
五、技术要点
(1)连接时，载体和外源DNA分子的摩尔比很重要，只有合适比例才能得到理想的连接效果;除构建文库等特殊需要外，外源片段与载体分子的摩尔比通常控制在1∶1～1∶4。
(2)加入的连接产物体积应该小于感受态细胞体积的5%;
(3)42℃热休克时，要保证温度的准确性，不能过高;
(4)进行粘端连接前，最好先将外源DNA和载体分子于45℃保温55min，使粘端解链，再将混合物冷却至0℃，然后再加入缓冲液和酶，混匀后进行反应;
(5)平端连接通常在室温(＜30℃)进行，末端浓度应大于1μmol，且所需酶量为粘端连接的10～100倍。单价阳离子(如150～200mmol/L NaCl)或聚乙二醇(从5% PEG4000到15% PEG8000)均可提高平端连接的效率。
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