实验二十 菌种保藏
一、实验目的
掌握微生物菌种保存的方法。
二、实验原理
按微生物菌种的特性选用最佳的保藏方法，使菌种不死、不衰、不乱。选用休眠体如分生孢子、芽孢等，并要创造一个低温、干燥、缺氧、避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能较长期地维持其休眠状态，要使其新陈代谢处于最低水平，又不会死亡，从而达到长期保藏的目的。
方法主要有:斜面或半固体穿刺菌种的冰箱保藏法、石蜡油封藏法、沙土管保藏法、冷冻干燥保藏法和液氮保藏法等。
在菌种保藏之前，一定要设法保证菌种是典型的纯培养物。
三、实验方法
1.常用的简易保藏法——移植保藏法
常用的简易菌种保藏法包括斜面菌种保藏、半固体穿刺菌种保藏及用石蜡油封藏等方法，这些方法是一般实验室和工厂普遍采用的菌种保藏方法。
通常将在斜面上或半固体上生长的菌种直接放到2～10℃冰箱中保藏，使微生物在低温下维持其缓慢生长，当营养成分被逐步耗尽后应该重新移植于新鲜培养基上;如此间隔一段时间移植一次(一般为3个月)，这种保存菌种的方法就叫移植保藏法或传代培养保藏法。定期移植的间隔时间随微生物种类而定。一般不产芽孢的细菌间隔时间较短，约2周至1个月移植1次。放线菌、酵母4～6个月移植1次。
石蜡油封藏法则是将灭菌的石蜡油加至斜面菌种或半养的菌种上，以减少培养基内水分蒸发，并隔绝空气，减少氧的供应，从而降低微生物的代谢。它放在4℃冰箱中一般可保藏一年至数年。
2.沙土管保藏法
(1)取河沙(其量决定于试验的要求)用40目左右的筛子过筛，除去粗颗粒和杂质，用10%的稀盐酸浸泡过夜或煮沸30min，倒掉酸水，用自来水冲洗至中性，去水后晒干或烘干，备用，也可以直接作沙土管保藏菌种用。
(2)取非耕作层的黄土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性，碾碎，用100目左右的筛子过筛，除去粗颗粒，备用，也可以直接作土壤管保藏菌种用。
(3)按1份黄土，3份沙的比例掺和均匀，装入10ml的小试管或冻存管中，每管约1～2g，塞上棉塞，15磅灭菌1h，放温室培养，使未杀灭的菌生长，48h后再15磅灭菌30min，这样培养、灭菌，再培养，再灭菌需进行两次，然后烘干备用。
(4)进行抽样无菌检查，每10支沙土管抽一支，先用接种环在营养肉汤琼脂平皿上画线做无菌检查，然后将砂土倒入营养肉汤培养基中作无菌检查，37℃培养48h观察，若仍有微生物生长，则需要将全部沙土重新灭菌，再抽样做无菌试验，一直到完全无菌，才可用于保藏菌种。
(5)选择孢子层生长丰满，菌苔良好的培养物，以无菌水洗下，制成孢子或细菌悬浮液，混合均匀。用无菌吸管吸取悬液，每支沙土管中加入0.1～0.5ml，以刚刚使沙土润湿为宜，用接种针搅匀，保藏放线菌可不制成悬液，直接用接种针挑取孢子拌入沙土管中。
(6)将沙土管放入真空干燥器内，用真空泵抽干水分，或在真空干燥器内再放入五氧化二磷，待五氧化二磷吸水成糊状时进行更换，直至沙土管干燥为止。
(7)抽样检验，10支接种的沙土管抽一支，用接种环取出少量沙土，接种于营养肉汤斜面和在营养琼脂平皿上画线，培养后观察细菌生长情况和有无污染，有的需对细菌或孢子计数，以观察保藏过程中菌种的存活情况，经检验无杂菌污染，存活情况良好的沙土管，可放冰箱或室内干燥处保藏，可以一年检验一次，此法适合于芽孢杆菌、放线菌及抗菌素和酶制剂工厂的菌种保藏，一般可保藏菌种2～10年不等。
3.薄膜保藏法
(1)将无色透明玻璃纸剪成2～4cm2纸片若干，以吸水纸做隔层，分层放置于培养皿内。用常规干热或湿热灭菌，也可用γ射线辐射(钴60)灭菌，剂量200万～5000万仑琴。取聚乙烯塑料薄膜用低频热合器粘合成4cm×6cm方形夹层菌种保藏袋，一端开口，采用多层塑料袋密封包装，用γ射线200万～500万仑琴灭菌;如果用耐高温塑料薄膜做成保藏袋，便可用湿热法103.4kPa 20min灭菌，上述灭菌后的材料，均需按常规做无菌试验，确证无菌，备用。
(2)配制保藏菌株所需培养基琼脂平皿:将待保藏的菌株制成细胞或孢子悬浮液(用无菌生理盐水)，无菌操作将灭菌的玻璃纸片放在琼脂平皿上，用无菌吸管取已制备好的细菌悬液0.2ml滴加在琼脂平皿上，用无菌玻璃涂棒均匀涂布。细菌和酵母菌一般培养3天，霉菌7天，放线菌10～20天，使菌苔生长良好或孢子丰满。无菌操作将长菌玻璃纸片与培养基分离，制得“菌种薄膜”，并放置于灭菌的大试管中，塞好棉塞。
(3)在室温或低温(－20℃左右)下，将“菌种薄膜”连同试管在干燥器内减压干燥，干燥器内同时放入五氧化二磷吸水;减压干燥装置最好装有无菌空气过滤管，保障减压干燥后菌种薄膜不被污染。
(4)将已干燥的“菌种薄膜”以无菌操作放置于灭菌的菌种保藏袋内，挤压排除袋内部分空气，用低频热合器将开口密封。放冰箱或室温保藏。
(5)薄膜保藏的抽样检验同上实例所述，只是在折封保藏袋时，要用酒精棉球擦拭消毒袋的外表，再用无菌剪刀剪开袋的封口处。该保藏法的特点是微型化，使菌种便于邮寄。
4.冷冻真空干燥保藏法
(1)冻存管准备:冻存管103.4kPa(15磅/平方吋)30min灭菌，烘干后备用。
(2)保护剂牛奶:用脱脂牛奶即可。将脱脂牛奶55.2kPa(8磅/平方吋)20min灭菌备用。或者用脱脂奶粉配置成1%(重量比)浓度后，55.2kPa (8磅/平方吋)20min灭菌备用。
(3)菌悬液的制备及分装:取选好保藏的菌种斜面，加3～6ml无菌脱脂牛奶，刮下菌苔，勿将培养基刮下，用无菌毛细滴管吸此菌悬液加入已准备好的无菌冻存管，每管加0.2ml左右，塞好棉塞，另取2支冻存管装入0.2ml含2% CoCl2的牛奶(粉红色)作指示瓶。
(4)预冻:取500ml烧杯一个，内铺4层纱布，倒入50ml 95%的乙醇，将上述装有细菌悬液的冻存管放入烧杯内，再放入200g左右的干冰，这时温度下降到－ 70℃左右，牛奶菌悬液在1min内冻结。也可将牛奶菌悬液置于液氮罐上层的气相中或低温冰箱(－80℃)中冻结。
(5)真空干燥:干燥瓶在冷冻槽中预冷后，取出冻存管，擦掉外面的冰，立即放入干燥器内，开启真空泵，使真空度在15min内达到66.65Pa (0.5mmHg)，随后逐渐达到13.33～26.66(0.1～0.2mmHg)Pa。约3h CoCl2指示瓶的颜色由粉红变为蓝色2～5h即可抽干，样品中的水分升华95%以上时，可见冻干的样品呈酥丸状或片状。样品干燥后从真空干燥器内取出冻存管时，应先缓慢地使真空干燥器内的大气压力逐渐平衡，然后再取出。现在实验室或工厂均有全自动真空干燥系统。
(6)测定水分:干燥后的样品中残留水分的测定有多种方法，用失重法较方便。
样品中水分%=失去的重量/样品的重量×100
残留水分在1%～3%的范围内，一般对保藏效果影响不大。
5.液氮超低温保藏法(一般情况下比较少)
(1)冻存管的准备:冻存管103.4kPa(15磅/平方吋)30min灭菌，烘干后备用。冻存管大小以容量1～2ml为宜。
(2)制备保护剂:配制20%甘油或10% DMSO水溶液，于112℃灭菌30min。
(3)制备细菌悬液:把单细胞微生物接种到合适的培养基上，并在合适的温度下培养到稳定期，对于产生孢子的微生物应培养到形成成熟孢子的时候，再吸适量无菌生理盐水于斜面菌种管内，用接种环将菌苔从斜面上轻轻刮下，制成均匀的悬液。
(4)加保护剂:吸取上述菌液2ml于无菌试管中，再加入2ml 20%甘油或10%DMSO，保护剂终浓度分别为10%或5%。
(5)分装菌液:将加有保护剂的菌液分装到冻存管中，每管装0.5ml不产孢子的丝状真菌，在做平板培养后，可用直径0.5mm的无菌打孔器将平板上的菌丝连同培养基打下若干个圆形菌块，然后用无菌镊子挑2～3块至含有1ml 10%甘油或5% DMSO的冻存管中。
(6)冷冻:将冻存管放于－40℃低温冰箱中冷冻约1h后再放入液氮中保藏。
(7)保藏:液氮超低温保藏菌种，可放在气相或液相中保藏。气相保藏，即将冻存管放在液氮罐内液氮液面上方的气相(－150℃)中保藏。液相保藏，即将冻存管放入提桶内，再放液氮(－196℃)中保藏。
(8)解冻恢复培养:将冻存管从液氮罐中取出，立即放入37℃水浴中解冻，约3min即可融化。可吸0.1ml融化的悬液，作定量稀释后进行平板计数，然后与冻结前计数比较，计算出存活率。
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