蛋白质末端的测定

时间：2023-02-09 百科知识版权反馈

【摘要】：实验二十二　蛋白质N末端的测定一、实验目的掌握二甲氨基萘磺酰氯与蛋白质或氨基酸结合的条件;了解氨基酸衍生物在聚酰胺薄膜上获得分离的原理和操作;掌握蛋白质N末端氨基酸的测定方法。

蛋白质末端的测定_病毒生物实验

实验二十二　蛋白质N末端的测定

一、实验目的

掌握二甲氨基萘磺酰氯与蛋白质或氨基酸结合的条件;了解氨基酸衍生物在聚酰胺薄膜上获得分离的原理和操作;掌握蛋白质N末端氨基酸的测定方法。

二、实验原理

蛋白质或多肽的DNS标记:荧光试剂二甲氨基萘磺酰氯(dansyl-Cl简称DNS-Cl)与蛋白质或多肽的N-末端游离氨基结合，生成带有荧光的DNS-蛋白质或DNS-肽。这些衍生物很稳定，在6mol/L盐酸中110℃水解12min，除少数DNS-氨基酸有部分破坏外，大部分DNS-氨基酸几乎不破坏，再经过有机溶剂反复抽提，可得到较纯的DNS-N末端氨基酸。

层析:聚酰胺薄膜上含有大量的酰胺基团，这些基团能与DNS-氨基酸上的羧基形成氢键而产生吸附作用。由于不同的氨基酸有结构上的差异，因此形成氢键的强弱就决定了吸附力的大小。在层析中，又因展层剂与被分离物在聚酰胺表面竞争形成氢键，使DNS-氨基酸在膜表面产生吸附、解吸附的连续过程，达到彼此分离。将胰岛素N-末端的DNS-氨基酸R_f值与标准氨基酸的DNS-衍生物(DNS-氨基酸)的R_f值作对照比较，就可确定胰岛素N-末端的氨基酸为何种氨基酸。

三、实验材料及器材

1.试剂

(1)甘氨酸、苯丙氨酸(层析纯)用0.2mol/L NaHCO₃配成浓度为1.5mg/ml的溶液。

(2)胰岛素(层析纯)用0.2mol/L NaHCO₃配成浓度为2.5mg/ml的溶液。

(3)DNS-Cl丙酮液(2.5mg/ml)、重蒸6mol/L盐酸(分析纯)、0.2mol/L碳酸氢钠溶液(优级纯)、苯(分析纯)、乙酸乙酯(分析纯)、冰乙酸、甲酸(88%分析纯)、重蒸1mol/L盐酸(分析纯)。

2.器材

(1)聚酰胺薄膜。

(2)小钟罩(用7 cm×10cm的次品级离心管代替)、玻璃小指管(0.5cm×8cm)、紫外层析灯、超级恒温水浴锅、玻璃真空干燥器、自动控制加热干燥器、电吹风、电炉、酒精喷灯、毛细管、长滴管、培养皿(直径6cm)、表面蒸发皿(直径5～6cm)。

四、实验操作方法

1.标准氨基酸的DNS化

(1)用0.2mol/L NaHCO₃液配制甘氨酸和苯丙氨酸溶液，其浓度为1.5mg/ml，然后各取0.1ml于小试管中，并加入DNS-Cl丙酮液0.1ml，用胶布封住小试管。

(2)摇匀，在40℃水浴里，保温2h。

(3)置玻璃干燥器里，60℃真空干燥，除去丙酮。

(4)加1～2滴水，用1mol/L HCl调pH值至2～2.5。

(5)加约0.3ml乙酸乙酯，摇匀，待分层后，吸取上层的乙酸乙酯，这样反复抽取3～4次。

(6)收集合并的乙酸乙酯提取液(如果里面带有水，摇动一下，就会在试管试壁上出现很小的水珠)，然后真空干燥，蒸去乙酸乙酯。

(7)层析时，可加少量丙酮(1～3滴溶液，便可点样)。

2.DNS-蛋白质的制备

(1)用0.2mol/L NaHCO₃溶液将欲检测的蛋白质配成2.5mg/ml。然后取0.2ml加入小试管，加0.2ml DNS-Cl丙酮液，摇匀，胶布封口。

(2)置40℃的水浴锅中，保温2h。

(3)在60℃真空干燥，除去丙酮，剩余的固体为DNS-蛋白质。

(4)加6mol/L HCl 0.2ml溶解，用细长滴管将样品转移到(0.5cm×8cm)的玻璃小指管中，在酒精喷灯上封口。

(5)在108℃的烘箱里水解过夜(12h)，水解出来的液体应是无色或稍带黄色。

(6)将指管口打开后，把水解液倒在表面皿上，在电炉上微微蒸干，再加0.1ml水，约用半滴1mol/L HCl调pH 2～2.5。

(7)用0.6～1.2ml乙酸乙酯分三次抽提，然后将合并液转移到小试管中。

(8)在60℃真空干燥，除去乙酸乙酯，层析前加1～2滴丙酮，便可点样。

3.DNS-氨基酸的层析

在聚酰胺薄膜(7×7)的左下角距两边1cm处画一点(C点)，在距C点1cm，距左边2cm，距下边1cm处画一点(A点)，在左上角距左边2cm，距上边1cm处画一点(B点)(图22-1所示)。

在A点处用毛细管点上样品DNS-末端氨基酸，在B点处点上DNS-Gly，其样品直径2～3mm，在溶剂系统Ι中进行第一向展层，直到溶剂前沿距顶1cm，取出聚酰胺薄膜，吹干，在C点处点上DNS-Phe，将聚酰胺薄膜转90°角，在第二种溶剂系统中进行第二向展层，直到溶剂前沿距顶0.5cm，取出聚酰胺薄膜，吹干。