，－分子的高级结构

3．2．1　Cu，Zn－SOD分子的高级结构

3．2．1．1　Cu，Zn－SOD的二级结构

Raman光谱测定牛血Cu，Zn－SOD的二级结构表明：含有3．0%的α螺旋，41．5%的β结构及51．9%的无序结构，与X射线晶体结构分析和傅里叶红外光谱得出的结论十分相近。与Cu，Zn－SOD的二级结构相比较，其金属取代衍生物Cu，Ni－SOD的β结构含量相对减少而无序结构含量增加。用光谱法测定Cu，Ni－SOD活性为Cu，Zn－SOD的40%，这说明SOD的活性随β结构的减少，无序结构的增加而降低，这是由于在SOD中，其每个亚基的活性中心均是β折叠相互环绕而形成的一个长而深的活性通道，铜和锌位于其中，锌起稳定结构的作用，而铜主要起催化作用。β折叠的减少，可能改变了活性中心的结构，尤其是Cu（Ⅱ）周围固有的配位环境，因而使酶活性降低。

图3－6　Cu，Zn－SOD亚基结构示意图

β折叠片以箭头表示，Z字型代表二硫键，2个长环由β折叠片伸出形成活性通道的上部与下部，Cu、Zn处于活性中心的底部。从所示方向看Cu离子处于分子的边缘，Zn离子埋藏于分子内部。右下小图为β桶的希腊环拓扑图。

Cu，Zn－SOD酶的相对分子质量较大，约为32kD，每个亚基均由8股反平行折叠片组成一个展开的圆桶，其外部有三个长环，Cu、Zn离子位于距离长通道底部6．3处，居于桶外表面两个长环之间。一个二硫键起到稳定结构的作用。图3－6为Cu，Zn－SOD亚基结构示意图。

在Cu，Zn－SOD家族中，以牛红细胞SOD的研究最为透彻。对植物中SOD的研究较少，现以菠菜叶中的SOD晶体结构为例加以说明。

Cu，Zn－SOD的每个亚基中，除1～2小段螺旋外，其余均为β折叠片和环状结构。154个氨基酸残基形成由8股反平行的β折叠组成的一个展开圆桶和三个外部的环。图3－7标示出菠菜叶Cu，Zn－SOD二级序列及主链氢键图。

图3－7　菠菜叶Cu，Zn－SOD二级结构的框架图及主链间氢键

在Cu，Zn－SOD的每个亚基结构中，154个氨基酸残基形成8股反平行的β折叠片，组成的一个展开圆桶和三个外部的环。主链的氢键连着β折叠片，稳定整个β桶结构。

除去二硫键（Cys57－Cys146）与盐键以外，肽链像一条连贯的绳索不被间断，8个反平行的折叠股形成一个希腊钥匙形（折叠桶与牛血Cu，Zn－SOD具有相同的拓扑结构，从N－端开始顺时针前进，三个长环由它们所连接的一折叠股来命名）。如图3－7所示，在154个残基中，有71个残基是β结构，73个残基参与环的组成（36个在环6，5上；3个在环4，7上；24个在环7，8上）。二硫键S—S键长为2．08，与小分子的二硫键S—S键长相似。

菠菜叶Cu，Zn－SOD与牛血Cu，Zn－SOD的结构异同点如下。

（1）相似处　①具有类似的拓扑结构，除配位残基外，在活性部位周围的一些功能重要的残基也被保留在SOD结构中，如Arg143，Thr137，Gly141，Asp124。

②八个上边缘的残基与牛Cu，Zn－SOD的结构相同，包括Thr136，Thr137，Gly138，Asn139，Ala140，Gly141，Gly141和Arg143。从SOD保留下来的相同残基可以看出，不同来源的SOD具有较好的同一性和保守性。

（2）不同处　菠菜叶Cu，Zn－SOD的活性中心Cu^2＋上缺少一个配位的水分子。

3．2．1．2　Cu，Zn－SOD的单体结构

A．pH5．0条件下还原型牛红细胞Cu，Zn－SOD单体结构

这种来自牛红细胞的SOD是一个相对分子质量为32kD的同型二聚体。每个单体部分都包含一个锌离子和一个铜离子，但只有铜是催化作用所必需的。

酶在稳定状态下颜色由绿向蓝的转变表明，在该酶催化周期中，铜离子在＋2和＋1两氧化状态之间相互转变。通过X射线衍射方法及化学、物理方法的研究，对于牛、人类及两栖动物的红细胞的氧化型Cu，Zn－SOD的结构特点已有很好的认识，与来自酵母、菠菜和原核生物的Cu，Zn－SOD一样，具有独特的三级结构，如图3－8所示。该三级结构包含8条反平行的β折叠形成的桶及环（Ⅰ—Ⅶ）。活性部位位于β桶外壁与伸展的环Ⅶ之间，环Ⅶ在圆锥形狭窄凹槽的底部，其中的凹槽主要是为了容纳超氧化物底物。凹槽由带电的残基包围着，这些残基能够通过静电作用与底物连接。凹槽中含一个Cu离子和一个Zn离子，Cu离子与四个His的N原子连接，还与一个H₂O疏松连接。其中的His61在正常情况下架在Cu，Zn之间，Zn与两个His和一个Asp组成四面体型。

图3－8　牛红细胞Cu，Zn－SOD单体结构图示

（摘自S Mangani，et al．，JBIC，1998）

Cu，Zn－SOD单体的折叠草图及活性部位凹槽的草图分别如图3－8中的（a）和（b）所示。后者显示了二级结构的排序及相关的活性部位残基。

B．Cu，Zn－SOD的四级结构

三维结构的一般概貌如下。

（1）二聚体中的两个亚基由一近似的二重轴联系。

（2）二聚体中的每个亚基为由8条反平行β－片层形成的桶状结构，如图3－9所示。

图3－9　牛红细胞Cu，Zn－SOD的高级结构

牛红细胞Cu，Zn－SOD是一个相对分子质量为32kD的功能性的同质二聚体，每个亚基包含1个Cu原子和1个Zn原子。Cu，Zn－SOD亚基的结构核心是一个由8股反平行的β折叠围成的圆筒状结构——β桶（β－barrel），被三个较长的、位于外部的环状（p）区域所连接。

（3）每个亚基中包含一个Cu原子和一个Zn原子，它们之间的距离为6左右，形成酶的双金属催化中心。

（4）活性中心距酶表面约10左右。

Cu，Zn－SOD存在三个功能重要的区域：第一结构域从序列49到84，形成了暴露的长环，含有和Cu/Zn配位的His和Asp残基；第二个结构域从序列121到144，组成了第二个活性位点外露环（active－site lid p），这一区域含有7个静电的残基，Glu132，Glu133，Lys136，Thr137和Arg143位于活性通道的上部边缘，可识别超氧阴离子底物；第三个结构域是从残基145到153的羧基末端β链（βstrand 8h），它对亚基的连接起着重要的作用。