几种常用的分离和测定同工酶的方法

12．2．1　几种常用的分离和测定同工酶的方法

12．2．1．1　电泳

区带电泳是最常用的分离同工酶的方法，采用高分辨率的支持物如淀粉凝胶或聚丙烯酰胺凝胶可获得满意的分离效果。近年来采用等电聚焦电泳还可以分出一级结构相同而空间构象不同的酶分子。酶分离后，再加入底物保温，并用类似于组织化学的特殊方法来鉴定底物的减少或产物的生成。但是能被电泳法分离的不一定是同工酶，酶带的数目也不一定代表同工酶的数目，因为某些酶蛋白可与电泳介质中的带电物质结合，改变其分子大小及电荷，从而改变电泳速度。例如：LDH可与血清中的免疫球蛋白A或G结合而形成相对分子质量从300×10³到1　000×10³、等电点从pH为6．3到7．2的各条酶带。过去在人血清电泳时发现的“巨淀粉酶”（macroamylase）实际上是淀粉酶和免疫球蛋白A的复合物。这些复合物都不是同工酶。相反，两种电泳速度不同的同工酶，如其中一个和带电的小分子物质结合后，其电泳速度恰巧与另一个相等，则两种同工酶在电泳时分离不开而只出现一条酶带。故不能单凭电泳来鉴定是否为同工酶。

12．2．1．2　层析

大多数同工酶的相对分子质量比较接近，而表面电荷差别较大，故一般较少用分子筛层析而用离子交换层析来分离同工酶。采用阳离子或阴离子树脂则取决于同工酶的等电点及其在不同pH值时的稳定性。离子交换层析可用于纯化或制备不同的同工酶，但其分辨率低于电泳。

亲和层析是利用同工酶和相应的配基（如底物、辅酶、抑制剂、抗体等）亲和力不同的原理，将同工酶混合物通过固相的配基，再用缓冲液分别将吸附程度不同的同工酶洗脱下来，即可达到分离的目的。此法特异性高，特别适用于分离和提纯同工酶。

12．2．1．3　热稳定性

利用同工酶热稳定性的不同，将含有两种同工酶的混合样品加热处理后，可以较特异地破坏其中一个不耐热的同工酶。因此测定加热前后的活性，可在不需分离的情况下分别计算出两种同工酶的活性。此方法简易，但准确性较差。

12．2．1．4　动力学

原级同工酶对底物的特异性、亲和力或对各种抑制剂和激活剂的敏感性常不相同，这些动力学的差别常被用于测定或区别同工酶。例如，ALD同工酶有三种纯聚体即肌型（A4）、肝型（B4）和脑型（C4），它们对底物1，6－二磷酸果糖（fructose diphosphate，FDP）及1－磷酸果糖（fructose 1－phosphate，F1P）的亲和力差异很大。A4催化FDP和F1P分解的速度比值为50，即几乎不能作用于F1P；而B4的比值为1，催化两种底物分解的速度相等，C4介于A4和B4之间。在A4和B4混合的样品中，分别测定FDP或F1P为底物时的活性，即可大致推测样品中A4和B4的相对比值。LDH同工酶也有不同的底物专一性，如心肌中的LDHB4（或LDHH4）对α－羟丁酸的亲和力远大于肝脏或骨骼肌中的LDHA4（或LDHM4）。

又如己糖激酶（hexokinase，HK）和葡糖激酶又称Ⅳ型己糖激酶（glucokinase，GK）是催化葡萄糖受ATP磷酸化的同工酶，HK对葡萄糖的Km约为0．1mmol·L^－1；而GK则高至10mmol·L^－1左右。当HK和GK共存时，在2．5mmol·L^－1葡萄糖浓度时测得的酶活性减去对照值后主要为HK的活性；而在100mmol·L^－1葡萄糖时测得的活性则为HK和GK活性的总和，由此可算出GK的活性。动力学法虽然简单，不必分离同工酶即可分别测定，但不易找到只作用于同型同工酶的抑制剂或激活剂。

12．2．1．5　免疫法

多基因位点的原级同工酶与复等位基因同工酶或次级同工酶比较，其氨基酸组成常有较大的差别，故有不同的抗原性。利用纯化的同工酶在异种动物中制备抗血清，再加至同工酶的混合样品中，该抗体即可与相应的同工酶抗原形成免疫复合体而沉淀，而将另一型免疫性不同的同工酶留在溶液中，从而达到分离的目的。有时沉淀时可回收全部酶活性，如各型碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）同工酶，测定沉淀的活性即可定量。如果抗体将酶活性全部抑制，沉淀中免疫复合物没有活性，如各型CK同工酶，则测定上清液中的残余活性即为另一型未被沉淀的同工酶的活性。利用放射免疫法还可以精密而特异地测定微量的同工酶。此外，免疫法还可以区别组织中某一同工酶活性的增高是由于激活还是酶蛋白增多的结果，因后者有抗原量的增加，可用免疫定量法（如火箭电泳法）测定出来，而前者的酶蛋白抗原并不增加。