免疫学方法

13．3．9　免疫学方法

13．3．9．1　放射性免疫测定法

（1）原理：用SOD作为抗原免疫动物，分离出抗血清继而分离出抗SOD抗体，将抗体标记放射性同位素如₁₂₅I，就可以按照放射免疫法测定SOD。

（2）测定方法：将分离纯化的SOD作为抗原，取抗原1mg，以完全Freund佐剂乳化，皮下注射入兔，然后隔离2～3周再注射0．5mg，除第1次注射外，共注射3次。取出心脏血，分离出抗血清，然后从抗血清中分离出抗SOD抗体，将抗体用放射性同位素如₁₂₅I标记，按放射免疫法测定SOD。

（3）方法特点：本法只能测定SOD的量，而不能测出SOD的活性，因为SOD抗体不能区分天然SOD与变性失活的SOD。该法测定的是样品中SOD的真实含量，特异性较好，用该法已可成功地测出健康人与病人的红细胞SOD。如果将抗天然与变性SOD的抗体分离出来，标记放射性同位素或β－半乳糖苷酶，其灵敏度可大为提高。免疫法优点很多，但缺点也很明显，如专一性过高，抗人SOD的抗体只能与人的SOD发生抗原抗体反应。这样一来，要测定动物体内的SOD，还要分别制备不同动物种属的SOD，不仅手续繁琐，而且给工作带来很大的不便。另该法用到放射性标记，操作过程中应注意做好安全防护，防止放射性污染。

（4）实例——放射性免疫法测定SOD。

①仪器：液体闪烁计数仪，离心机，电磁搅拌器。

②试剂：SOD标准品；Na¹²⁵I；Sephadex－G75；牛血清白蛋白；氯胺T：用磷酸盐缓冲液配制成10g/L的溶液；1%碘化钾溶液；偏重亚硫酸钠：用磷酸盐溶液配成30g/L的溶液；0．2mol/L、0．5mol/L磷酸盐缓冲液，pH为7．6；雄性家兔。

③试验步骤。

SOD的分离与纯化。

抗SOD抗血清的制备：对家兔进行5～10mg卡介苗注射，进行基础免疫。7d后，取提纯的SOD 1mg，加福氏佐剂充分乳化，对家兔背部皮内进行多点注射。一个月后，再取提纯的SOD 1mg，加福氏不完全佐剂，于家兔背部皮内及脚掌多点注射进行第二次免疫。再隔10d，以1mg SOD水剂进行腹腔注射，加强免疫。取耳血，用免疫扩散法或单向扩散法等测定抗体效价。杀死动物采血，室温凝固30min左右，再置37℃水浴使之凝固，最后置于4℃下充分凝固，离心后吸取血清。测定血清抗体效价，加入0．02%叠氮化钠，－20℃保存。

SOD的¹²⁵I标记：向一试管中加入纯化的SOD 100～300μg及2～3毫居里（1居里＝37GBq）Na¹²⁵I，置水浴。用微量注射器喷射注入1mg氯胺T，在电磁搅拌器上搅拌氧化5min。加入偏重亚硫酸钠3mg终止反应。加入1%碘化钾溶液一滴，反应液呈透明。如出现棕黄色，说明氧化尚未终止，应继续滴加偏重亚硫酸钠直至反应无色透明。用Sephadex G－75柱纯化标记的SOD。测量标记SOD的放射性强度（微居里/mL）。

样品测定：向测试管中加入0．01mol/L的磷酸盐缓冲液300μL，pH为7．4，含6．7%正常兔血清。加入样品100μL或不同浓度的SOD标准品，加入适当稀释的兔抗血清200μL，加入¹²⁵I标记的SOD100μL。对照管中除不加样品或SOD标准品外，其余与测定管相同，以磷酸盐缓冲液补足总体积。混匀，于4℃下放置18h。加入适当稀释的含8%PEG 6000的二抗羊抗兔IgG的沉淀剂400μL，4℃条件下作用6h。5　000r/min离心10min，弃上清液，对沉淀进行Y计数。

SOD含量计算：测定管的放射性强度值标记为“T”，对照管的放射性强度标记为“B”，计算B/T比值。根据标准SOD不同用量（X）及相应的放射性强度B/T比值（Y），绘制标准曲线。然后再根据样品测定值（B/T）由标准曲线计算出样品液中的SOD含量。

13．3．9．2　化学发光免疫测定法

（1）原理：把发光剂如鲁米诺及其衍生物N－氨基己基－N－乙基异鲁米诺（AHEI）加入一个免疫反应体系中，取代放射性同位素，最终以发光强度来计算表征待测物质的量。

（2）测定方法：提取纯化目标SOD，制备抗SOD的抗血清，对SOD进行AHEI标记，并检测标记SOD的发光值。把各管放在发光检测仪的测定位置上，原位加入过氧化氢液200μL启动发光，仪器自动记录发光峰值。

（3）方法特点：与放射性免疫法相比，本法标记物较为稳定，标记好的SOD标准品可置－20℃下存放6个月以上。用发光剂取代放射性同位素的优点是避免了放射性污染，标记物可长期保存，而在灵敏度和特异性上均可与放射性免疫测定相媲美。

（4）实例——化学发光免疫分析法测定SOD。

仪器：发光检测仪。

试剂：氨基己基乙基异鲁米诺（AHEI）；双－二乙基－己二亚胺；三乙胺；甲醇；0．1mol/L Na₂CO₃；Sephadex G－25柱；10mmol/L磷酸盐缓冲液，pH为7．4；稀释液：用上述缓冲液配制2g/L明胶溶液，加入NaN₃至终浓度为1．5mmol/L；分离剂：用上述缓冲液配含50g/L的聚乙二醇（PEG6000）溶液，用此溶液稀释的二抗溶液作为分离剂；氯化血红素液：用上述磷酸盐缓冲液将氯化血红素配制成15μmol/L的溶液；过氧化氢液：取30%H₂O₂用双蒸水稀释至30mmol/L；2mol/L NaOH。

试验步骤：

提取纯化欲分离的SOD，制备抗SOD的抗血清。

SOD的AHEI标记：①活化：将AHEI 10μmol和双－二乙基－己二亚胺17．5μmol于20℃溶解在50μL三乙胺及950μL无水甲醇中，然后置于含氩气的带橡胶塞的容器内活化2～4h。取出50μL在25℃下于蒸发器上干燥。②标记：将干燥后的残余物溶于25μL甲醇中，加入纯化的SOD 1mg（溶于0．1mol/L Na₂CO₃，pH为9．5），于20℃下作用4　h。③纯化：将混合物通过Sephadex G－25柱，洗脱去非标记物。④检测标记SOD的发光值。

样品检测：

按表13－11加样，各管充分混合，4℃下放置过夜，5　000r/min离心10min，弃去上清液，用2mol/L NaOH溶液200μL沉淀，在50℃下保温3h。待温度降至室温后，加入氯化血红素液800μL，充分混匀。把管子放在发光检测仪的测定位置上，原位加入过氧化氢200μL启动发光，仪器自动记录发光峰值。

表13－11　化学发光免疫法试剂加样表

SOD含量计算：根据SOD标准液（ng）的自然对数值ln（X）及对应发光峰值［（B₀－N）/（B－N）］的自然对数值ln（Y）绘制标准曲线。将样品管的发光峰值与标准曲线相比较，计算出SOD的含量。

13．3．9．3　ELISA方法

（1）原理：根据酶联免疫吸附法的基本原理，用单克隆抗体检测样品的SOD含量。本法主要用于检测血浆等样品中的细胞外SOD（EC－SOD）。

（2）测定方法：辣根过氧化物酶（HPR）标记抗EC－SOD单克隆抗体，将标记的抗ECSOD单抗溶于碳酸钠缓冲液，向酶标板中加入以上抗EC－SOD单抗，4℃下过夜。用洗涤缓冲液逐孔清洗，加入封闭液，4℃下存放，直至测定。加入待测样品或用封闭液稀释的EC－SOD标准液，室温下放置2h。倾去液体，用洗涤缓冲液清洗3次。再加入经封闭液稀释的HPR标记抗EC－SOD单抗溶液，室温孵育2h。用洗涤缓冲液洗3次，加入底物液，室温下显色30min。加入H₂SO₄，以双蒸水调零，在492nm处测定吸光度。根据EC－SOD标准液的不同浓度及其对应的吸光度值，绘制标准曲线。再由样品测得的吸光度值查出对应的SOD含量。

（3）方法特点：该法的特异性决定于抗EC－SOD单抗的特异性，抗体不应与其他类型的SOD酶有交叉反应。该法适用于测定血浆、组织液、尿液及关节液等体液中的EC－SOD含量。在体外，仅有包括成纤维细胞、胶质细胞等的少数细胞种类能够产生和分泌EC－SOD，而内皮细胞或上皮细胞等并不能产生EC－SOD。