植物抗氧化能力的基因工程

18．2．7　植物抗氧化能力的基因工程

提高植物体内抗氧化酶类活性及增强抗氧化代谢的水平是增强植物抗逆性的途径之一。利用基因工程手段获得抗氧酶高效表达的转基因植株，为研究其在清除活性氧方面的功能及作用提供了可行途径。清除活性氧的重要性已在几种酶类的转基因植株中得到证实，转基因植株中SOD、APx、GR和过氧化氢酶的高效表达提高了植株对氧化胁迫的抗性。

在各种抗氧化酶类基因工程研究中，最深入的是SOD同工酶。人们企望通过提高植物SOD活性来达到延缓植物的衰老和增强植物抗逆性，使得植物SOD基因工程研究成为当今的一个热点。早在1987年人们已从玉米中克隆到编码细胞质中Cu，Zn－SOD的基因，随后又从马铃薯和菠菜中分离到细胞质Cu，Zn－SOD基因。1988年又先后从菠菜、马铃薯和矮牵牛花克隆到叶绿体Cu，Zn－SOD基因。1989年Bolwer从N．plumbaginifolia分离获得线粒体Mn－SOD基因和定位于叶绿体的Fe－SOD基因。豌豆胞质Cu，Zn－SOD的cDNA长度为738　bp，包含一个456bp的开放阅读框架，可编码一个152个氨基酸残基、M_r为18kD的蛋白。大豆Fe－SOD基因长度约1　000bp，编码含248个氨基酸残基、M_r为27　824的蛋白。

植物SOD基因之间有较高的同源性。玉米、马铃薯、菠菜的胞质Cu，Zn－SOD没有这一序列；大豆叶绿体Fe－SOD基因有一个叶绿体引导肽序列，而来自线粒体Mn－SOD基因则含有一个线粒体引导肽序列。

几种SOD cDNAs已从植物中得到克隆并用来转化不同的植物，最终获得SOD活性增强的转基因植株。SOD在转基因烟草、苜蓿、马铃薯和棉花叶绿体中的过量表达提高了它们对氧化胁迫的耐受性；SOD在苜蓿线粒体和马铃薯细胞质中的过量表达也具有同样的效果；转基因苜蓿叶绿体中SOD的过量表达提高了植株对冻害的耐受性；Mn－SOD在转基因烟草叶绿体中的过量表达提高了植株对盐胁迫的耐受性，而且盐胁迫下转基因植株中SOD和APx的活性都较对照提高了10倍，SOD和APx的活性分别比野生型提高了1．3倍和3倍。Pitcher等（1991）将CaMV35S启动子与矮牵牛叶绿体Cu，Zn－SOD基因重组为一个嵌合基因，并将此基因导入烟草中而获得转基因烟草植株，其Cu，Zn－SOD活性提高了30～50倍，但植株并未提高对Paraquat或臭氧引起的氧化损伤的耐受性。Pitcher等（1996）在烟草中超表达了豌豆的Cu，Zn－SOD基因，转基因植株提高了对臭氧胁迫的耐受力。Van Breusegem等（1999）将烟草的Cu，Zn－SOD基因导入到玉米中，转基因玉米中的SOD得到高表达，转基因玉米在低温胁迫下的抗氧化能力得到提高。Alison等（2000）将烟草的Mn－SOD基因导入到玉米中，转基因玉米中的SOD得到高表达，而且转基因玉米的脱氢抗坏血酸还原酶、谷胱甘肽还原酶等抗氧化酶活性得到提高。Gupta等（1993）得到一种超表达叶绿体Cu，Zn－SOD基因的转基因烟草植株，它的SOD活性提高3倍，对光介导的甲基紫精伤害的抗性有明显提高，这种增强的保护作用只在甲基紫精浓度在一个较窄的范围内存在，在较高甲基紫精浓度时转基因植株与对照就没有差异。Gupta还发现，高表达叶绿体基因的烟草成熟植株，用强光和低温处理6小时后再回到正常环境，这种转基因植株的光合能力可恢复90%，而对照植株的光合能力完全丧失。

转基因植株中存在的这些差别说明：SOD同工酶可能具有不同的抗氧化功能；转基因植株中基因表达水平有所差异，SOD同工酶的表达只在一定的范围内是有效的，超出这一范围的过量表达往往是有害的；SOD与其他活性氧清除酶类如抗坏血酸过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶之间的酶活性平衡可能是很关键的。

在光培养中，只有叶绿体中SOD的过量表达赋予植株显著的Mv抗性，而在暗培养中，SOD在叶绿体及线粒体中的过量表达均赋予植株较高的Mv抗性，目前研究表明：强光下生长的植株较弱光下生长的植株具有较高的Mv耐受性，这可能是因为SOD只是叶绿体抗氧化酶类中的一环，只有当活性氧的清除能力不受其他抗氧化酶类及底物制约时，SOD的过量表达才能提高植株对氧化胁迫的耐受性，在光照条件下生长的转基因植株能够提高这些酶及底物的表达，从而增强了植株对Mv的抗性。

实验表明，在过量表达叶绿体Mn－SOD的植株中，其内源SOD同工酶的活性都较非转基因植株低。同时Gupta等的实验也证明豌豆叶绿体Cu，Zn－SOD在烟草中的过量表达，导致了转基因植株内源叶绿体Cu，Zn－SOD活性的降低，这说明内源SOD同工酶的表达是由超氧化物阴离子或其发生反应产生可动的信号分子诱导的。外源SOD基因的过量表达可以降低超氧化物阴离子或信号分子的浓度，从而导致内源SOD基因表达的降低。

由于胁迫反应中基因表达的复杂性，通过传统育种及基因工程获得耐逆植株受到了一定的限制。目前大家期望通过对模式生物比较基因组学的研究，能够获得新的基因，通过对胁迫下其表达模式的分析可为更有效的基因工程奠定基础。实验显示，在干旱胁迫下植物缺少一些被认为与干旱胁迫无关的转录子及基因进行表达，对其表达模式的进一步研究发现抗性植株具有独特的调控基因；对盐胁迫下水稻细胞悬浮培养物的780个表达序列标签子（EST）的随机测序表明，盐胁迫诱导了与三羧酸循环相关的某些酶的表达；随机选取220个拟南芥ESTs进行序列分析证实，与渗透胁迫有关的15个基因进行了表达，且表达幅度分别增加2～50倍；此外，对基因表达调控因子的研究发现，胁迫反应性转录因子在拟南芥中的组成型表达提高了转基因植株对冷害的耐受性；拟南芥脱水反应组分结合蛋白（CaMV35S组成型启动子）在胁迫诱导型启动子调控下的表达、提高了转基因植株对冷害、干旱及盐胁迫的耐受性。