转基因植物的制备方法

18．4．2　转基因植物SOD的制备方法

目前，从植物体内提取纯化SOD已有一些成熟方法，基本工艺如下：破碎植物组织；制备粗酶液；硫酸铵分级沉淀除杂蛋白；超滤浓缩，柱层析得纯品。吴丹奇等用硫酸铵分级沉淀、Sephadex G－100柱层析、DEAE－52柱层析的方法从芥蓝叶中提取纯化了超氧化物歧化酶，最高纯化倍数为45．2，比活性为97．3u/mg蛋白（肾上腺素法测定），获得的SOD经SDS－PAGE呈现单一条带。曾仕廉等采用硫酸铵沉淀和柱层析法从辣椒提取纯化出了Cu，Zn－SOD，1kg辣椒制得166．96mg SOD，比活为328．84u/mg蛋白。俞纯方等用丙酮处理、硫酸铵沉淀和柱层析法提取了莴苣中的SOD。

但是要从野生植物中得到SOD，因受来源影响，非常有限。因此，人们希望通过转基因手段在植物中大量表达SOD，进而分离纯化，丰富SOD生产数量，降低生产成本，从而使其在医药、食品及日用化工方面得到更为广泛的应用。利用转基因植物大规模生产外源蛋白质是经济实用、安全可靠、优秀的蛋白质生产系统。利用转基因植物已成功地表达了多种外源蛋白，对植物表达的外源蛋白的理化性质、生物活性、动物实验以及人体实验方面也取得了重要进展。刘晓鹏、袁勤生等利用克隆人的铜锌超氧化物歧化酶（hCu，Zn－SOD）基因，构建了马铃薯块茎特异性启动子驱动hCu，Zn－SOD基因的植物表达载体pPSCu－SOD；用三亲交配法将重组质粒pPSCu－SOD转化到农杆菌LBA4404，转化马铃薯基因得到了转基因植株。PCR和PCR－Southern分析证明，hCu，Zn－SOD基因已整合到马铃薯基因组中，Western blot分析表明，hCu，Zn－SOD基因在转基因马铃薯植株的块茎中得到表达，用NBT光还原法测定转基因马铃薯块茎的SOD活性并对该转基因植物中特异表达的SOD进行了分离纯化及性质研究，经硫酸铵沉淀、Sephadex G－100凝胶过滤和DEAE－52层析，从200g转基因马铃薯块茎中纯化得到15．2mg酶，酶比活达3　595u/mg蛋白；SOD－PAGE法测得其亚基相对分子质量为18．8kD。