酵母发酵生产乙醇综合实训

实训二　酵母发酵生产乙醇综合实训

项目一　活性干酵母的活化

实训目的

（1）了解活性干酵母的基本特点。

（2）掌握活性干酵母的活化技术。

实训原理

应用活性干酵母的技术关键在于活化技术。活性干酵母是利用现代生物技术精心制造的产品，因使用对象不同而存在差异。活化技术应掌握好活化用水、活化温度及活化时间。

实训试剂与实训器材

1.实训试剂

白糖、红糖、葡萄糖。

2.实训器材

（1）电子天平。

（2）恒温培养箱。

（3）恒温水浴锅。

（4）温度计。

（5）普通光学显微镜。

（6）血球计数板。

（7）加样枪（25～50μL）。

（8）250mL三角瓶。

（9）250mL烧杯。

（10）菌种：市售活性干酵母。

实训步骤

1.活化技术的要求

（1）活化用水：最好使用温开水，以减少杂菌污染。

（2）活化用水用量：活化用水用量是干酵母的20～25倍。

（3）活化用水的营养成分：活化用水中可加白糖、红糖或葡萄糖，活化用水含糖量为1%～2%。

（4）活化温度：耐高温活性干酵母的活化温度以38～40℃为宜，普通活性干酵母的活化温度以35～37℃为宜。

（5）活化时间：一般以10～20min为宜，即产生气泡1～2min后便可投入使用。

2.活化方法

（1）活化用水的制备：称取1.5g葡萄糖或白糖，或将2g红糖溶解在100 mL　45℃以上的温开水中。

（2）活化液（酵母种）的制备：称取5g活性干酵母，加入到38～40℃的活化用水中，搅拌两次，待活性干酵母全部溶解完毕，静置到产生气泡1～2min便可接种，置于发酵罐中发酵。

3.质量要求

（1）细菌总数＞1×10⁸个／mL。

（2）出芽率＞25%。

（3）死亡率＜1%。

（4）镜检：细菌均匀，无杂菌污染。

结果与讨论

（1）比较采用纯水和分别加入白糖、红糖、葡萄糖等的活化用水活化活性干酵母的优劣。

（2）简述工业上使用活性干酵母的优点和意义。

注意事项

（1）在对活性干酵母进行活化时，活化用水一定要用洁净的水，防止感染杂菌。

（2）活化温度不能过高，不超过40℃，避免由于活化温度过高使酵母菌失活。

项目二　固定化技术及乙醇发酵

实训目的

（1）了解固定化技术的原理。

（2）掌握用海藻酸钠制备固定化酵母细胞的方法。

（3）掌握活性干酵母生产乙醇的方法。

实训原理

固定化技术包括固定化酶技术与固定化微生物技术。固定化微生物技术是指用化学手段或物理手段将游离微生物细胞定位于限定的空间区域，以提高微生物细胞的浓度，使其保持较高的生物活性并反复利用的方法。使微生物细胞固定化的方法有多种，工业上常用包埋法固定微生物细胞。根据包埋剂的特性，如海藻酸钠呈溶液状，将细胞加入混匀，然后在氯化钙中凝固，凝胶颗粒中的微小空格使微生物细胞固定，海藻酸钠凝固的颗粒能反复使用，微生物细胞在空格中可进行新陈代谢，也可利用微生物细胞中的酶进行酶促反应。

由于固定化技术既不需要把酶从细胞中提取出来，又不需要对酶加以纯化，因而酶活性损失小。研究和应用表明，固定化技术有微生物密度高、反应速度快、耐毒害能力强、微生物流失少、产物分离容易、处理设备小型化等优点。它在生物化学、化学工程、微生物工程、医学等领域得到了高度重视，广泛应用于治理有机废水及重金属污染的废水，以及食品、发酵、制药、医学诊断等领域。

实训试剂与实训器材

1.实训试剂

（1）海藻酸钠、无水氯化钙、青霉素、蛋白胨、葡萄糖、蒸馏水。

（2）0.2mol／L氯化钙溶液200mL。

2.实训器材

（1）温度计和糖度计。

（2）酒精计。

（3）20mL注射器。

（4）电炉。

（5）电子天平。

（6）高压蒸汽灭菌锅。

（7）酸碱度计。

（8）三角瓶、量筒、蒸馏瓶。

（9）恒温培养箱。

（10）菌种：活性干酵母。

实训步骤

1.酵母细胞的固定化

（1）称取2.5g海藻酸钠，加蒸馏水至100mL，边加热边搅拌，待溶解冷却后加10g活性干酵母，搅拌均匀。

（2）制备0.2mol／L氯化钙溶液200mL，将海藻酸钠和酵母细胞混合液装入已灭菌的注射器中，装上大号针头，利用注射器滴入氯化钙溶液中。

（3）固定化的细胞株用无菌水洗涤2～3次。

2.乙醇的发酵

（1）发酵营养液的制备：蛋白胨5g，葡糖糖20g，蒸馏水100mL，混匀，测混合液的pH值，装入500mL三角瓶中，在121℃条件下灭菌20min，每毫升培养基加5μg青霉素。

（2）发酵培养：将上述制备好的固定化酵母细胞加入发酵培养基中，置于恒温培养箱（28℃）中培养2～3d。

结果处理

（1）取发酵液200mL，置于500mL蒸馏瓶中，加100mL蒸馏水蒸馏，用100mL量筒接收馏出液100mL，摇匀，用温度计测定馏出液的温度，用酒精计测酒精度，通过查“酒精度、温度换算表”计算出乙醇浓度。

（2）将蒸馏瓶中的发酵液冷却，取出100mL置于量筒中，用糖度计测其糖度，用酸碱度计测其pH值。

注意事项

（1）海藻酸钠溶液配制的关键操作就是在加热的同时要不停地搅拌，因为与琼脂相比较，海藻酸钠的黏性更大，加热时如果不注意搅拌，很容易就会出现焦煳，导致实验失败。

（2）在海藻酸钠溶液的配制过程中，控制好海藻酸钠的浓度也是很关键的一点。在加热海藻酸钠的过程中，水分会不断地蒸发掉，导致所配制的海藻酸钠溶液过浓，最后制作出来的凝胶珠拖尾现象十分严重，不能形成规则呈圆形的凝胶珠，而像是一条蚯蚓。但如果所配制的海藻酸钠溶液过稀，能形成圆形的凝胶珠，但是凝胶珠的颜色不是浅黄色而是白色，所固定的酵母细胞数目太少，实验也会不成功，所以在加热海藻酸钠的过程中，注意控制蒸发掉的水分。

（3）在制作凝胶珠时，要利用注射器推出圆形不拖尾的凝胶珠，就必须注意推注射器的力度和速度，应做到先稍用力快速推进注射器，当有一滴混合液溢出注射器时，立即放慢和减轻推注射器的速度和力度，让混合液滴入氯化钙溶液中，就能形成圆形的凝胶珠。推注射器的速度不能过快，否则很容易造成拖尾现象。

（4）注意控制注射器与氯化钙溶液液面之间的距离。注射器离氯化钙溶液液面过高，海藻酸钠和酵母细胞混合液的液滴在碰到氯化钙溶液液面时的冲击力过大，容易摔破，不利于形成圆形的凝胶珠，若距离过近，则容易出现拖尾现象，比较适当的距离是两者之间相距30～35cm。

思考题

（1）海藻酸钠滴进氯化钙溶液中为何会凝固？

（2）若原料品种不同，使用不相同的酵母菌种，是否会得到不同的产品？请举例说明。

知识链接

酒精计的使用方法

测量酒精度通常用酒精计，酒精计又称酒精比重计。酒精计是根据乙醇浓度不同，乙醇比重不同，浮体沉入酒液中排开酒液的体积不同的原理而制成的。当酒精计放入酒液中时，酒液的浓度越高，酒精计下沉也越多，乙醇比重也越小；反之，酒液的浓度越低，酒精计下沉也越少，乙醇比重也越大。

测量乙醇浓度时，将部分乙醇倒入量筒中，注意不要倒得过满，再把温度计和酒精计放入量筒里（不要贴筒壁），稍等片刻，目光平视看准温度与酒精度，通过“酒精度、温度换算表”查出标准条件（20℃）下的酒精度。使用酒精计测量酒精度时，应注意：由于表面张力的原因，酒液与酒精计长轴的接触处会出现弯月面，因此，在读数时，应以水平面为准。