分离及光学特性的观察

实验实训十四　叶绿体色素的提取、分离及光学特性的观察

一、实训目标与内容

（一）实训目标

1.学会叶绿体色素提取和分离的方法

2.了解叶绿体色素的性质

3.叶绿体荧光现象的观察

（二）实训内容

1.叶绿体色素的提取

2.叶绿体色素的分离及荧光现象的观察

二、实验原理

叶绿体含有叶绿体色素，叶绿体色素主要包括叶绿素a、叶绿素b、叶黄素和胡萝卜素，可用有机溶剂乙醇、丙酮等将它们提取出来。纸层析法是分离叶绿体色素最简单的方法。它的原理是利用混合色素中各个成分物理、化学性质的差别，分别以不同程度分布于两相中（固定相和流动相）。由于它们以不同的速度移动，从而达到分离的目的。

叶绿体色素容易受光的破坏，变成褐色。叶绿体色素具有荧光现象。叶绿素分子的镁可被铜替代，形成铜代叶绿素。叶绿体色素对不同波长的光具有吸收作用。

三、实训材料与用品

实训材料：菠菜、菜心等植物叶子。

实训仪器用品：天平、研钵、烧杯、量筒、滤纸、表面皿、剪刀、90%～95%乙醇、汽油、漏斗、滴管。

层析液配方：石油醚20ml+丙酮2ml+苯1ml。

四、操作与观察

（一）纸层析法分离叶绿体色素（方法1）

称取新鲜叶片（菜心、菠菜等叶均可）1g，剪碎，放在研钵中，加乙醇5ml，共研磨成匀浆，静置5分钟。

用滴管吸取上面的色素提取液4～5滴。一滴一滴地滴在滤纸的中央（滤纸要平放在表面皿或培养皿上）。待色素点风干后，向该色素点上慢慢滴加汽油，使四种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）在滤纸上分离出来，四种色素在滤纸上的移动速度是胡萝卜素（橙黄色）>叶黄素（黄色）>叶绿素a（蓝绿色）>叶绿素b（黄绿色）。

（二）纸层析法分离叶绿体色素（方法2）

称2g新鲜绿色叶片，剪碎，放在研钵中，加入5ml乙醇，共研磨成匀浆，过滤，该滤液即为色素提取液。

取一块预先干燥处理过的定性滤纸，将它剪成长约10cm、宽约1cm的滤纸条。

用毛细管吸取色素提取液，在滤纸条的一端（约距这一端的1cm处）画出一条滤液细线，等滤液干燥后，再重复画4～5次。

将滤纸条的另一端（约距这一端1cm处）折成“V”字形，并将它挂在放有层析液的烧杯壁上（注意：色素线要略高于层析液面，且滤纸条下端最好不要碰到烧杯壁），盖上培养皿。

经几分钟后，观察色素带的分布，最上端为胡萝卜素，其次是叶黄素，再次是叶绿素a，最后是叶绿素b。

（三）叶绿体色素的性质鉴定

1.叶绿体色素的提取

取菠菜（或其他植物）叶子2g，加石英砂和碳酸钙少许，乙醇约5ml，研磨成匀浆，再加乙醇15ml，用漏斗过滤，即为色素提取液。

2.叶绿素的荧光现象

取上述色素乙醇提取液少许于试管中，在反射光和透射光下观察色素提取液的颜色有什么不同。反射光下观察到的溶液颜色，即为叶绿素产生的荧光现象。

3.光对叶绿素的破坏作用

取上述色素乙醇提取液少许，分装在2支试管中，1支试管放在暗处，或用黑纸包裹，另1支试管放在强光下（太阳光），经2～3小时后，观察两支试管中溶液的颜色有何不同。

4.铜在叶绿素分子中的替代作用

取上述色素乙醇提取液少许于试管中，1滴1滴地加入盐酸，直至溶液出现褐绿色，此时叶绿素分子已遭破坏，形成去镁叶绿素，然后加醋酸铜晶体1小粒，慢慢地在酒精灯上加热溶液，使溶液又产生亮绿色，此即表明铜已在叶绿素分子中替代了原来镁的位置。

5.黄色素和绿色素的分离

将叶绿体色素的酒精提取液10ml倒入分液漏斗中，倾斜漏斗，并沿其壁慢慢加入15ml汽油（或乙醚），轻轻摇动5分钟，静置片刻后，溶液即分为两层，上层为绿色的汽油层，主要含有叶绿素。为使色素分离完全，从分液漏斗放出下层酒精溶液，将之盛于干燥的试管A中，再往留在分液漏斗中的汽油层色素溶液加入95%酒精5ml，轻轻摇动之，弃去下层黄色溶液，并将上层绿色的叶绿素汽油层提取液放入试管B中，用棉花塞住试管口。同样将试管A所盛的黄色酒精溶液倒入分液漏斗中，加入汽油5ml，轻轻摇动分液漏斗，将下层黄色溶液放入试管C中，塞以棉花。最后用分光镜观察绿色溶液和黄色溶液的吸收光谱。

6.黄色和绿色溶液的吸收光谱的观察

用手持分光镜观察黄色溶液和绿色溶液的吸收光谱。

五、作业与思考题

1.将纸层析法分离叶绿体色素的实验结果贴在实验报告纸上，并给予分析。

2.解释叶绿体色素的光学性质。

3.叶绿素a、叶绿素b、叶黄素和胡萝卜素在滤纸上的分离速度不一样，为什么？

4.什么叫叶绿素的荧光现象？铜代叶绿素有荧光现象吗？