血清中磷脂的测定

实验十四　血清中磷脂的测定

【实验目的】

掌握血清中磷脂测定的原理和操作方法。

【实验原理】

磷脂(PL)并非单一的化合物，其分子内含有磷酸基的多种脂质，磷脂是这一类物质的总称。血清中PL包括60%左右的卵磷脂、2%～10%的溶血卵磷脂、2%磷脂酰乙醇胺和20%左右的鞘磷脂。

血清PL定量方法包括测定无机磷的化学法和酶法两大类。

化学测定法过程包括:①抽提分离;②灰化;③显色和比色三个阶段。以有机混合试剂(无水乙醇、乙醇)抽提血清中磷脂，再用浓硫酸和过氯酸消化抽提液中的脂类和其他有机化合物，用硝酸盐与磷反应生成有色化合物，比色定量。本法可用于组织细胞中磷脂的抽提和定量。

酶测定法可分别利用磷脂酶A、B、C、D等4种酶作用，加水分解，测定其产物，对PL进行定量。一般多采用磷脂酶D(PL-D)进行定量。磷脂酶D因特异性不高，能水解血清中的卵磷脂、溶血卵磷脂和神经磷脂(三者占血清总磷脂的95%)，释放出胆碱，胆碱在胆碱氧化酶作用下生成甜菜碱和H₂O₂，在过氧化物酶作用下，H₂O₂与4-氨基安替吡啉和酚发生反应生成红色醌亚胺化合物，在500nm波长下，其颜色深浅与这三种磷脂的含量成正比。PL-D可作用于含有卵磷脂、溶血卵磷脂和鞘磷脂以及含胆碱的磷脂，这几种磷脂约占血清总磷脂的95%。本法快速准确，便于自动生化分析仪器进行批量检测。

【实验材料】

人血清。

【实验器材】

试管、恒温水浴锅、高速冷冻离心机、分光光度计等。

【药品试剂】

1．抽提液:无水乙醇∶乙醇=3∶1。

2．消化液:用1L密器，加水约500 ml，置冷水中缓缓加浓硫酸280 ml到水中，冷却后加过氯酸(70%)65 ml，混匀，加蒸馏水至1000 ml。

3．显色剂:称取钼酸铵2．5 g和无水醋酸钠8．2 g，加蒸馏水溶解并稀释至1 L，临用时取此液体9份加新配的VC液(10%)1份，混合即可。

4．1 mg/L参考液:称干燥KH₂PO₄0．4393 g溶于蒸馏水中，转移至100 ml的容量中，用蒸馏水加至刻度。4℃冷藏。

5．0．04 mg/ml参考液:取上述1 mg/L储存液2 ml加水至50 ml，4℃冷藏。

6．酶应用液:每100 ml Tris-His缓冲液(50 mmol/L，pH7．8)中含45 U磷脂酶D，100 U胆碱氧化酶，220 U过氧化物酶，12 mg 4-氨基安替吡啉，20 mg酚，8 mg CaCl₂·2H₂O，0．2 gTritonX-100。

7．2 mg/ml卵磷脂标准液:纯卵磷脂，临用前配制，含0．5% TritonX-100。

【实验方法】

1．化学法:

(1)准备三支试管，分别标记为空白管、测定管和标准管。在测定管中加入0．1 ml血清和2．4 ml抽提液，盖上试管盖后，室温下充分振荡10分钟。然后在3000 r/min条件下，室温下离心10分钟。

(2)将测定管中的上清液取出1 ml置于一个新的测定管中，在沸水浴中蒸干。

(3)消化:在蒸干后的测定管中加入0．1 ml水和0．2 ml消化液;在空白管中加入0．1 ml水和0．2 ml消化液;在标准管中加入0．1 ml 0．04 mg/ml参考应用液和0．2 ml消化液。将三支试管放置在电炉上面加热消化，直到测定管中由黑色转为清亮为准。室温静置冷却。

(4)显色:分别向三支试管中加入2 ml显色剂，在60～70℃水浴条件下保温10分钟，然后在室温冷却。

(5)测定:以空白管调零，在700 nm波长下测定标准管和测定管中的吸收值，分别记录为T和A。

(6)计算:

血清脂性磷浓度=A/T×10(mg/dl)

血清磷脂(以卵磷脂计)=A/T×10×0．3229(mmol/L)

2．酶法:

(1)在3 ml酶应用液中加入血清(测定管A)20μl，标准管(T)加标准液20μl，空白管加水20μl，放置37℃水浴10分钟后，波长500 nm，比色，空白管液调零。

(2)计算:

血清磷脂(mg/dl)=A/T×200

血清磷脂(mmol/L)=血清磷脂(mg/dl)×0．01292

【思考题】

简单叙述两种测定血清中磷脂含量的方法各有哪些优缺点。