测定蛋白质含量

实验三　考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质含量

【实验目的】

1．掌握Bradford法测定蛋白质含量的原理。

2．了解Bradford法的优缺点和适用范围。

【实验原理】

考马斯亮蓝是一种氨基三苯甲烷染料，可在酸性环境中与蛋白质形成由范德华力及静电作用的非共价复合物。考马斯亮蓝G250的最大光吸收峰在405nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大光吸收峰变为595nm，溶液的颜色也从棕黑色变为蓝色，所显示蓝色至少在1小时内是稳定的。在一定的范围内，考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物呈色后，在595nm下，光密度与蛋白质含量呈线性关系。因此可以用于蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物的高消光效应导致了该方法测定蛋白质含量的高敏感性，可以用来测定从10～100μg的蛋白质。

Bradford法的优点:①灵敏度高，最低蛋白质检测量可达10μg，比Lowry法约高四倍。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大得多。②测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。染料与蛋白质结合的过程大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样不仅费时而且需要严格控制时间。③干扰物质少，如干扰Lowry法的K⁺、Na⁺、Mg²⁺离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

Bradford法的缺点:①由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用γ-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。②仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有:去污剂、Triton X-100．十二烷基硫酸钠(SDS)和0．1 mol/L的NaOH。③标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

【实验器材】

可见光分光光度计、旋涡混合器、试管16支等。

【药品试剂】

1．标准蛋白质溶液:用γ-球蛋白或牛血清蛋白(BSA)，配制成0．1 mg/ml的标准蛋白质溶液。

2．考马斯亮蓝G-250染料试剂:称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 ml 95%的乙醇后，再加入100 ml 85%的磷酸，用水稀释至1 L。

【实验方法】

1．取10支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表3-4中的顺序，分别加入样品、水和试剂。每加完一管，立即混匀(注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难以消除)。第8、9、10管为未知样品中蛋白质含量的测定管。

2．加完试剂在室温放置5～10分钟后，即可开始在分光光度计上测定各样品在595 nm处的光吸收值A₅₉₅，空白对照为第1号试管。

【注意事项】

不可使用石英比色皿(因不易洗去染色)，可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

表3-4　　　　　　　考马斯亮蓝方法测定蛋白质含量

3．用标准蛋白质量(mg)为横坐标，用吸光值A₅₉₅为纵坐标作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A₅₉₅值，即可查出未知样品的蛋白质含量。一般情况下，0．5 mg/ml牛血清蛋白溶液的A₅₉₅约为0．5，0．05 mg/ml牛血清蛋白溶液的A₅₉₅约为0．29。

【思考题】

简单叙述考马斯亮蓝法测蛋白质含量的优缺点以及操作过程中的注意事项。

【附录】

考马斯亮蓝R250(Coomassie brilliant blue R250)。C₄₅H₄₄O₇H₃S₂Na，MW=824，λ_max=560～590nm。染色灵敏度比氨基黑高5倍。尤其适用于SDS电泳中微量蛋白质的染色。但蛋白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白质的染色不符合Beer定律，用作定量分析时要注意这点。

考马斯亮蓝G250，又名Xylene brilliant cyanin G。比考马斯亮蓝R250多两个甲基。MW=854;λ_max=590～610nm。染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而是形成胶体，能有选择地染色蛋白质而几乎无本底色。所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于做定量分析。

考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。待一两周后，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。

考马斯亮蓝G250是常用的蛋白质染料，作定性试验用，染色后为蓝绿色;考马斯亮蓝R250较敏感，做定量实验用，染蛋白质胶的效果较好，染色后为红蓝色。