用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响

实验十一　用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响

【实验目的】

1．初步掌握正交实验设计方法的使用。

2．求出蔗糖酶的最适温度和最适pH值。

【实验原理】

酶的催化作用是在一定条件下进行的，它受多种因素的影响，如底物浓度、酶浓度、溶液的pH值和离子浓度、温度、抑制剂和激活剂等都能影响催化反应的速度。通常是在其他因素恒定的条件下，通过对某一因素在一系列变化条件下的酶活性测定，求得该因素对酶活力的影响，这是单因素的简单比较法。本实验用正交法测定温度、pH值、底物浓度和酶浓度四种因素对蔗糖酶活性的影响，这是多因素(≥3)的实验方法。

正交法是通过正交表安排多因素实验，利用统计数学原理进行数据分析的一种科学方法，它符合“以尽量少的试验，获得足够的、有效的信息”的实验设计原则。正交试验法的程序为下列八个步骤:

(1)确定试验目的。实验目的是多种多样的，如找出产品质量指标的最佳组合、确定最佳工艺条件等。本实验的目的是为了提高酶的反应速度，提高酶的活力。

(2)选择质量特性指标。应选择能提高或改进的质量特性及因素效应。对于本实验来说就是产物(葡萄糖)生成量的多少。

(3)选定相关因素。即选择和确定可能对实验结果或质量特性值有影响的那些因素，可人为控制与调节的因素，如温度、pH值等。这些因素之间有相互独立性。

(4)确定水平。水平，又称位级，是因素的一个给定值或一种特定的措施，或一种特定的状态。水平也就是因素变化的各种状态。在确定水平时，应考虑选择范围、水平数和水平位置。如本实验的温度可以选择20℃、30℃、50℃三个水平。

(5)选用正交表。应从因素数、水平数以及有无重点因素需要强化考察等各方面综合考虑选用正交表。一般情况下，首先根据水平数选用2或3系列表，然后以容纳试验因素数，选用实验次数最少的正交表。如有重点考察的因素，则根据其多考察的水平数，选混合型正交表。

(6)配列因素水平，制订实验方案。按随机原则，把因素配列于选用的正交表中，制定实验的顺序、时间等，即制定实验具体方案。

(7)实施实验方案。按实验方案，认真、正确地试验，如实记录各种实验数据。

(8)实验结果分析。对实验中取得的各种数据进行分析。如从数据中直接选出符合或接近质量特性期望值的实验条件组。如不能采用直观分析方法，则应采用其他分析方法，确定各因素主次地位可用级差分析方法，定量分析各个因素对实验结果的影响程度，则用方差分析方法。

【实验材料】

纯化后的蔗糖酶。

【实验器材】

分光光度计、水浴锅、试管等。

【药品试剂】

同本章蔗糖酶活力测定实验所需试剂。

【实验方法】

1．实验设计:

(1)确定指标:即实验的结果。本实验的指标是酶活力。这里用A₅₂₀值表示。

(2)制定因素水平表:考察四个因素(温度、pH值、底物浓度和酶浓度)，每个因素取三个水平(如温度选择20℃、35℃和50℃三个水平)。水平是因素变化的范围(通常是根据专业知识确定。如无资料可借鉴，应先加宽范围再逐步缩小)内要进行实验的具体条件(表4-15)。可根据自己的设计选择相应因素的水平变化范围，如温度的选择可为20℃、30℃、60℃。注意各个因素的水平应该在酶反应条件的合理范围内!

表4-15　　　　　　　因素水平表

(3)选择正交表:可容纳三因素三水平的正交表有L9(34)、L27

(313)、L18(36×6)和L27(38×9)。本实验不考察各因素间的交互作用，也没设计混合水平，只有水平数均为3的四个因素，故选用L9(34)表(表4-16)。

表4-16　　　　　　　正交表L₉(3⁴)(举例)

(4)实验安排:根据因素和各因素的水平条件设计实验。总反应体积为2 ml。表4-17中列出了“1”号试管中的反应条件:蔗糖溶液即反应中的底物加入0．1ml(即因素3中的第一个水平);缓冲液的pH值为3，即因素2中的第一个水平，注意为了保证每支试管中离子浓度相同，加到每支试管中的缓冲液体积是一致的，即每支中加入0．2 ml的缓冲液;第一支试管中的反应温度为温度这个因素的第一个水平，即25℃;加入的蔗糖酶也是这一因素中的第一个水平，即0．02 ml，这里为了方便起见以蔗糖酶的体积表示，可以通过测定蛋白质含量计算出此时的酶浓度。再以“9”号试管为例:蔗糖溶液即反应中的底物加入0．3 ml，即底物这个因素中的第二个水平;缓冲液的pH值为6．5，即因素2中的第三个水平;反应温度为温度这个因素的第三个水平，即50℃;加入的蔗糖酶也是这一因素中的第一个水平，即0．02 ml。

表4-17　　　　　　　具体的实验安排

2．实验实施:

(1)将已配制好的三种不同pH值的0．2 mol/L的缓冲液装于试管中。缓冲液配制参照表4-18。

表4-18　　　　　　　缓冲液的配制

(2)酶活预实验，确定酶的稀释倍数(可根据产物稀释的倍数来确定酶的稀释倍数)，A₅₂₀在0．4～2．0之间即可。

(3)准备18支试管。其中9支为对照管，作为测量时的参比溶液，反应条件与试验管相同，不同之处在于酶加入的时间是在二硝基水杨酸和NaOH之后。其他9支试管为试验管，按照表4-18中的具体实验安排进行操作。以每支试验管相对应的对照管中的溶液调零测定520nm下的吸收值。

3．数据计算和分析:根据上述9支试管反应后的结果填写表4-20。在该实验中不需要计算出葡萄糖的实际得率，只需要测得的吸收值即可。如对于温度这个因素的第一个水平，共有3支试管是在第一个水平即25℃条件下进行的，即“1”号、“2”号和“3”号试管，将这三支试管测得的吸收值总和标记为A-K1，相应的A-K2即为“4”号、“5”号、“6”三支试管吸收值的总和;同理对于pH值这个因素，BK1即为“1”号、“4”号和“7”号三支试管吸收值的总和。

表4-19　　　　　　　正交法数据计算和分析

对于温度这个因素，A-K1、A-K2和A-K3哪个值最大，说明对应的水平是蔗糖酶相对最合适的反应温度;同理，其他的因素最适合的水平也通过比较K值来获得。

将各个因素中的最大K值减去最小的K值，获得的就是该因素的R值，即极差。比较四种因素的极差，极差最大的那个因素对于蔗糖酶的酶活性是至关重要的。

【思考题】

1．正交试验设计法与简单比较法及全面试验法相比较，有何优缺点?

2．设计实验方案时应遵循什么原则?