糖酵解中间产物的鉴定

实验一　糖酵解中间产物的鉴定

【实验目的】

1．掌握糖酵解中间产物的鉴定方法和原理。

2．熟悉通过酶的抑制作用调节代谢途径。

3．了解使中间产物堆积的方法在研究中间代谢中的意义。

【实验原理】

在细胞质中，一分子葡萄糖通过一系列反应转化为两分子丙酮酸，并伴随着ATP生成的一系列反应是有机体获得化学能的最原始的途径，也是原核生物和真核生物糖类物质分解代谢的共同途径。利用碘乙酸对糖酵解过程中的3-磷酸甘油醛脱氢酶特异地且不可逆地抑制作用，使3-磷酸甘油醛不再向前变化而积累。硫酸肼作为稳定剂，用来保护3-磷酸苷油醛使其不自发分解。然后用2，4-二硝基苯肼与3-磷酸甘油醛在碱性条件下形成2，4-二硝基苯肼-丙糖的棕色复合物，其棕色程度与2-磷酸甘油醛含量成正比。从而证明糖的分解代谢过程中，含有3-磷酸甘油醛的中间产物。

【实验材料】

新鲜酵母。

【实验器材】

试管(1．5 cm×15 cm)、吸量管(1 ml、2 ml、3 ml)、恒温水浴、烧杯(50 ml)、电子天平。

【药品试剂】

1．2，4-二硝基苯肼:0．1 g 2，4-二硝基苯肼溶于水100 ml 2 mol/L盐酸溶液中，储于棕色瓶中备用。

2．0．56 mol/L硫酸肼溶液:称取7．28 g硫酸肼溶于50 ml水中，这时不会全部溶解，当加入NaOH使pH值达7．4时则完全溶解。此液也可用于水合肼溶液配制，可按其分子浓度稀释至0．56 mol/L，此时溶液呈碱性，可用浓硫酸调pH值至7．4即可。

3．5%葡萄糖溶液。

4．10%三氯乙酸溶液。

5．0．75 mol/L NaOH溶液。

6．0．002 mol/L碘乙酸溶液。

【实验方法】

1．取小烧杯3支，编号，分别加入新鲜酵母0．3 g，并按表5-1分别加入各试剂，混匀。

表5-1　　　　　　　糖酵解中间产物的鉴定——发酵产生气泡观察

2．将各杯混合物分别倒入编号相同的发酵罐内，放入37℃保温1．5小时，观察发酵管产生气泡的量有何不同。

3．把发酵管中发酵液倾倒入同号小烧杯中并在2号和3号杯中按表5-2补加各试剂，摇匀后放10分钟并和第一支烧杯中内容物分别过滤，取滤液进行测定。

表5-2　　　　　　　糖酵解中间产物的鉴定

4．取3支试管，分别加入上述滤液0．5 ml，并按表5-3加入试剂和处理。

表5-3　　　　　　　糖酵解中间产物的鉴定——二硝基苯肼反应

室温放置10分钟后，分别向上述试管中加入0．5 ml2，4-二硝基苯肼，混匀后在38℃水浴保温19分钟，然后加入0．75 mol/L NaOH 3．5 ml，观察实验结果。

【思考题】

实验中哪一发酵管生成的气泡最多?哪一管最后生成的颜色最深?为什么?