图位克隆技术

实验二　图位克隆技术

【实验目的】

1.掌握图位克隆技术的原理和操作步骤。

2.利用图位克隆技术克隆EMS诱变突变体中的效应基因。

【实验原理】

利用物理方法或化学方法获得的植物突变体中突变的碱基位点是随机的，并且没有任何标记用于筛选突变基因，因此，需要使用图位克隆技术对突变基因进行克隆。

图位克隆(map-based clonig)又称定位克隆(positoinal cloning)，由剑桥大学的Alan Coulson在1986年首先提出。其基本原理是功能基因在基因组中具有相对较为稳定的基因座，通过对分离群体的遗传连锁分析将待分离的目的基因定位到染色体的某个具体位置上，再利用分子标记技术对目的基因进行精细定位，利用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，然后通过构建高密度的分子连锁图谱，不断缩小候选区域进而克隆该基因。即通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。

利用图位克隆技术克隆基因无需预先知道基因的DNA顺序以及其表达产物的有关信息，但是需要一个根据目的基因建立起来的遗传分离群体。

图位克隆技术主要包括以下4个步骤:

1.目的基因的初步定位。在目的基因的初步定位中首先要筛选与目标基因连锁的分子标记。利用目标基因的近等基因系或分离群体进行连锁分析，筛选出目标基因所在局部区域的分子标记。与此同时，构建并筛选含有大插入片段的基因组文库。常用的载体有cosmid、酵母人工染色体(YAC)以及P1，BAC，PAC等几种以细菌为寄主的载体系统。然后用与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库，获得阳性克隆。以阳性克隆的末端作为探针，筛选基因组文库，并进行染色体步行，直到获得具有目标基因两侧分子标记的大片段跨叠群。

分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传标记技术。确切地说分子标记就是一个特异的DNA片段或能够检出的等位基因，对其有效利用即可达到图位克隆基因之目的。常用的有基于分子杂交技术的限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、基于PCR技术的随机扩增多态性DNA RAPD标记(random amplified polymorphism DNA，RAPD)和简单序列长度多态性(simple sequence length polymorphisms，SSLPs)、基于限制性酶切和PCR技术的扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)及后来发展的基于芯片技术的核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)等。利用这些标记技术结合使用近等基因系分析可以快速将目的基因定位在某个染色体的一定区域。

2.目的基因区域的精细作图。通过整合已有的遗传图谱和寻找新的分子标记，提高目的基因附近区域遗传图谱和物理图谱的密度。

3.目的基因的精细定位和染色体登陆。利用侧翼分子标记分析和混合样品作图精确定位目的基因，然后以目标基因两侧的分子标记为探针，通过染色体登陆获得含目标基因的阳性克隆。

4.外显子的分离和鉴定。阳性克隆中可能含有多个候选基因。用筛选cDNA文库、外显子捕捉和cDNA直选法等技术找到候选基因，再进行共分离、时空表达特点和同源性比较等分析确定目标基因。当然，最直接的证明是进行功能互补实验。

功能互补实验是将该基因从基因组上克隆下来，然后构建到转基因载体中，通过农杆菌介导的方法(或者其他的转基因方法)将其转入突变体中。如果转化成功的突变体恢复野生型的表现型，则可以证明通过图位克隆获得的该基因是突变体中的突变基因，而该基因也是突变体中控制表现型的功能基因。

在本节中主要介绍利用图位克隆技术从拟南芥EMS诱变后的突变体中克隆基因的方法。拟南芥(Arabidopsis thaliana)是一种模式植物，具有基因组小(125 Mbp)、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成，但是测序工作的完成并不能完全揭示基因组中所有基因的功能，大约有40%的基因功能还是未知的。

利用图位克隆技术从拟南芥中获得突变基因时常常使用SSLP和SNP分子标记技术。SSLP是基于PCR的分子标记，在拟南芥基因组中有较多分布，而且具有共显性，检测方法简单，仅需设计引物来检测假定的SSLP标记;利用SNPs标记可以检测出拟南芥不同生态型之间基因组中单个核苷酸的差别。同时，在拟南芥中有着高密度的遗传标记，使利用图位克隆技术获得基因的时间大大缩短，一般仅需要拟南芥5个生长周期，即一年到一年半的时间就可完成基因的克隆。

【实验材料】

EMS诱变获得的拟南芥突变体。

【实验器材】

离心机、PCR仪等分子生物学常规仪器和设备。

【药品试剂】

PCR反应相关试剂，拟南芥分子标记相应的引物，DNA电泳相关试剂等。参见实验十七。

【实验方法】

1.突变体植株与另外一个生态型(Col-0或者Ler)的植株杂交(作图最常用的组合是Landsberg erecta×Columbia(Ler×Col))，这两个品系估计每1000kb内在4～11个位置存在差异)，收获F1代种子。然后将F1代种子进行播种，并观察F1代植株的表型，根据F1代植株的表型出现或者消失判定所研究的突变是显性还是隐性。此时还要求确认F1代植株是杂合体以及原来的生态型背景。

2.F1代植株自交获得F2代种子，大约播种600粒种子即可进行突变基因的粗定位(first-passmapping)。根据孟德尔分离规律，如果是隐性突变得出其中大约有150个个体可能是纯合体，如果是显性突变则150个个体是野生型。在这一代需要完成的工作是一方面提取纯合体(以隐性突变为例) DNA，分析基因型。然后用分布于拟南芥第五条染色体上的25个分子标记(相邻的两个标记之间大约相距20 cM)进行分析，确定突变基因与哪个或者哪几个标记是连锁的，然后用三点测交的方法来定义一个包含突变基因的大约20 cM的遗传间隔。接下来再引入新的分子标记把这个间隔缩小到大约4 cM。距离突变基因最近的两个分子标记将作为侧面标记而用于下面的进一步分析。

注:可以根据拟南芥数据库中的SNPs(single nucleotide polymorphisms)序列和插入/缺失多态性(insertion/deletion polymorphisms)序列，设计一系列分子标记(http://www．arabidopsis.org/)。

3.播种F2代群体用于突变基因的精细定位(fine-resolution mapping)，将包含突变基因的遗传间隔缩小到小于40kb(约0.16 cM)。一般需要3000～4000个F2代植物个体(包括粗定位时的600个F2代植物个体)来精确定位突变基因。

4.在确定了突变两侧相距小于40kb的两个分子标记之后，可通过测序找到突变基因。设计PCR引物扩增覆盖这40kb的多个重叠的500bp的片段，将这些片段测序后拼接起来以得到整个40kb的序列，然后将它与野生型植物(Col-0或者Ler)的序列进行比对，即可找到这个区域中的多个基因。

5.从候选基因中鉴定基因，最常用的方法是用含有目标基因的大片段克隆如BAC克隆或YAC克隆筛选cDNA文库，并查询生物数据信息库，待找出候选基因后，将这些候选基因进行下列分析以确定目标基因:

(1)精确定位法检查cDNA是否与目标基因共分离;

(2)检查cDNA时空表达特点是否与表型一致;

(3)测定cDNA序列，查询数据库，以了解该基因的功能;

(4)筛选突变体文库，找出DNA序列上的变化及与功能的关系;

(5)进行功能互补实验，通过转化突变体观察突变体表型是否恢复正常或发生预期的表型变化。功能互补实验是最直接、最终鉴定基因的方法。

【思考题】

1.简要叙述图位克隆的原理。

2.简单叙述图位克隆的操作步骤及各步中的注意事项。