过量表达的原理及基本步骤

实验十五　过量表达的原理及基本步骤

【实验目的】

1.了解和掌握植物发育生物学研究中常用过量表达载体的性质;

2.掌握转基因载体构建的一般方法和注意事项。

【实验原理】

花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子是组成型启动子，具多种顺式作用元件。其转录起始位点上游－343～－46bp是转录增强区，－343～－208和－208～－90bp是转录激活区，－90～－46bp是进一步增强转录活性的区域。Mitsuhara等利用CaMV35s核心启动子和CaMV 35S启动子的5＇端不同区段与烟草花叶病毒的5＇非转录区(omega序列)相连，发现两个CaMV 35S启动子－419～－90序列与omega序列串联后，将GUS构建在该启动子后面转入植株中，获得很高的GUS表达活性。另一种高效的组成型启动子Cs-VMV是从木薯叶脉花叶病毒(cassava vein mosaic virus，CsVMV)中分离的。该启动子－222～－173bp负责驱动基因在植物绿色组织和根尖中的表达。

在双子叶植物中过量表达某个目的基因大多采用人工改造后的CaMV 35S启动子，在单子叶植物如水稻中常采用泛素启动子。除了上面提到的高效表达的组成型启动子外，在植物发育生物学研究中经常使用的还有组织特异性表达启动子，如根特异启动子mas2'、叶肉细胞特异启动子C4Pdk和种子特异启动子napinB等。

为了获得过量表达目的基因的转基因植株，首先需要选择合适的植物转基因载体。在选择转基因载体时除了载体要满足植物转基因的基本要求外，还需要注意以下事项:

(1)受体植株是单子叶植物还是双子叶植物?如果是双子叶植物，可以选择带有组成型CaMV 35S启动子的转基因载体，如pBI121载体;如果是单子叶植物，则大多选择含有组成型泛素启动子的转基因载体，载体图谱见图1-11、图1-12所示。

图1-11　拟南芥中常用的过量表达载体pBI121图谱

(2)明确是需要组成型的过量表达目的基因，还是需要在植物特定组织部位表达目的基因。如果是组成型表达可以选择带有泛表达启动子的载体;如果是需要在特定的组织部位表达，则要选择带有合适启动子的载体。

(3)载体上面是否有合适的选择标记，如果受体植株已经具有某一抗生素(如卡那霉素)的抗性，那么在选择载体的时候避免选择利用卡那霉素进行筛选转基因植株的载体，此时可以选择具有潮霉素抗性或者是氯霉素抗性的转基因载体，从而方便筛选转基因植株。

(4)如果目的基因在植株中过量表达后可能会导致植株致死，

图1-12　水稻中常用的过量表达载体图谱pUbiO(由pCAMBIA I1301改造)

此时可以选择具有诱导性启动子的转基因载体，如地塞米松诱导的GR系统、雌二醇诱导的ER系统、杀虫剂诱导的EcR系统等。这些启动子系统的优点是只有当诱导物存在时才能启动基因表达，去除诱导物后，基因表达很快被关闭，这样就可以人为、精确、快速地控制基因的表达。

【实验方法】

这里只列出步骤，具体的实验方案参照本书中的其他章节以及分子生物学操作手册。

1.载体的选择。

2.从基因组序列中克隆目的基因，并测序验证。

3.选择合适的酶切位点，将目的基因构建到载体中。

4.重组载体转化农杆菌。