启动子和融合转基因植株的染色分析

实验二十六　启动子和GUS融合转基因植株的染色分析

【实验目的】

1.通过本实验使学生掌握植物组织中GUS染色的原理和方法。

2.掌握利用标记基因研究启动子活性的方法。

3.掌握和了解研究基因时空表达的方法。

【实验原理】

在稳定的遗传转化植株中，利用简单的组织化学检测可精确地分析gusA(uidA)融合基因的时空表达模式。在植物组织和细胞中，用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid，X-gluc)作为底物可以进行GUS(β-glucuronidase)活性的精确定位。这一反应分两步进行:首先是切割葡萄糖醛酸部分，产生无色的吲哚氧基中间产物，随后吲哚氧基中间产物成为不溶的蓝色沉淀。

利用GUS染色研究基因的表达模式有如下优点:①在大多数植物组织中，GUS活性的本底低;②反应产物不扩散，在表达基因的植物细胞内积累;③通过简单的扩散或真空渗入，底物易被植物细胞吸收。

缺点:①对于活体组织不太合适;②GUS表达水平很高的组织中会发生无色反应产物渗漏的现象，可以通过在底物溶液中加入氧化剂氰化钾或亚铁氰化钾或者二者都加(终浓度为5mmol/L)使这种渗漏减至最少;③检测结果虽然可以做到相对定量，但是不能对基因表达产物的多少进行绝对的定量。

用于染色的植物材料的制备方法因涉及的特定组织和器官不同而异。例如，拟南芥的根、花和叶片以及烟草幼苗的根就可以不作任何预处理而直接染色。但是，烟草和马铃薯的茎和叶必须在染色前切成薄片(1～3mm)。操作体积大的组织和样品，可以选用真空渗入法帮助底物和酶渗入细胞。

GUS标记和染色在植物发育生物学领域有着重要的应用。常常将其构建到某个基因启动子的下游，从而研究该基因在植物体内的表达情况。有时将GUS构建到诱导启动子的下游，以研究该启动子下游基因在植物生长发育中的分布情况。

【实验材料】

烟草和/或拟南芥转基因植株。

【实验器材】

恒温培养箱，显微镜，微量移液器等。

【药品试剂】

1.X-gluc:用N-N-二甲基甲酰胺配制成20mmol/L的储存液，分装成每管100μl，于－20℃保存。

2.底物溶液:加1mmol/L X-gluc于100mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)，含10mmol/L EDTA，1～5mmol/L铁氰化钾，1～5mmol/L亚铁氰化钾。

3.0.1% TritonX-100。

4.95%乙醇。

【实验方法】

将组织放入1.5ml离心管中，加入100～200μl底物溶液。

【注意事项】

如果是用微量滴定板进行温育，要保证封好样品，以防止样品变干。

2.37℃温育过夜(如果需要时间可以短一些)。

3.如果必要可以将植物组织浸泡在95%乙醇中除去叶绿素(蓝色沉淀在乙醇中很稳定)。

4.如果组织需要固定后进行切片，那么温育过夜后即可以进行固定。

【思考题】

1.GUS活性检测有哪些优缺点。

2.GUS活性检测中有哪些注意事项?附: GUS活性的定量检测(引自《拟南芥实验手册》(Weigel and Glazebrook，2004)

原理: GUS活性的定量检测通常以4-MUG(4-methylumbellyferylβ-D-glucuronide)为底物，反应生成的4-MU(4-methyl umbelliferone)，可以进行定量测定。

一、试剂

1.GUS提取液: 50mmol/L磷酸钠(pH7.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1% SDS，0.1% TritonX-100，上述溶液混合后可以室温保存，使用前加入10mmol/L巯基乙醇和25μg/ml PMSF。

2.4-MUG: 25mmol/L溶解在GUS提取液中。

3.4-MU: 10mmol/L溶解在水中。

二、步骤

1. 200～500mg组织放入微量离心管中，液氮速冻后保存于－80℃。

2.植物组织材料液氮速冻后用微量研棒研磨，确保组织保持在冷冻状态。

3.加入150μl GUS提取缓冲液，保存在液氮中直到所有的材料已经准备完毕。

4. 4℃，15000r/min离心10分钟。

5.将上清液转移到新的离心管中，并在冰上放置。

6.准备反应混合物: 1 mmol/L 4-MUG溶解在GUS提取缓冲液中。在每个样品中加入上述混合液1m l，然后在37℃保温。

7.对于每个样品要事先准备好两个玻璃管，分别装900μl 1mol/L碳酸钠以终止反应。

8.加10μl上述的上清液到反应管中，精确反应10分钟后，转移其中的100μl到已准备好的终止液(1mol/L碳酸钠)中。

9. 20分钟后，再转移100μl的反应液至终止液中终止反应。

10. 4-MU的标准液:将100nmol/L、250nmol/L和500nmol/L 4-MU保存液加到终止液中。

11.在酶标仪上面测定数值。激发波长: 365nm;吸收波长: 455nm;滤波器: 430nm。

12.制备标准曲线，测定样品。

13.样品中蛋白质含量的测定。

14.计算GUS的活力，单位为nmol/min/mg，即每分钟反应条件下，每毫克植物组织中GUS反应生成4-MU的量(nmol)。