实验三十二 免疫共沉淀技术
免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其优点为:①相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态;②蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响;③可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。其缺点为:①可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用;②两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用;③必须在实验前预测目的蛋白质是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
【实验目的】
1.掌握免疫共沉淀的原理。
2.掌握免疫共沉淀技术研究蛋白质相互作用的一般步骤。
【实验原理】
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质新的作用。
【药品试剂】
1.Grinding buffer: 50mmol/L Tris( pH 7.5)，150mmol/L NaCl，10mmol/L MgCl2，0.1% NP-40，1mmol/L PMSF和1×Complete protease inhibitors(Roche)。
2.2×sample buffer for SDS-PAGE。
3.Protein A-sepharose 4B Fast Flow beads(Sigma-Aldrich)。
4.PBS(pH 7.4)。
5.硼砂溶液(0.2mol/L硼砂溶解在PBS，pH9.0)。
6.Coupling solution: 4.5ml硼砂溶液和45mg dimethylpimelidate(40mmol/L)。
7.乙醇胺溶液: 0.2mol/L乙醇胺溶解在PBS中，pH9.0。
【实验方法】
操作参照《拟南芥实验手册》(Weigel and Glazebrook，2004)。
一、细胞抽提物的准备
1.在微量离心管中将200mg组织材料在液氮中研磨。
2.加入200μl Grinding buffer后继续研磨直到溶液清亮。
3.在4℃条件下，以最大速度离心10分钟，将上清液转移到新的离心管中。
4.再次在4℃条件下，以最大速度离心5分钟，将上清液转移到新的离心管中。
5.取上清液10μl，加入10μl 2×sample buffer for SDS-PAGE，在95℃下变性4分钟，然后保存于－20℃，备用。
二、抗原-抗体复合物偶联到protein A琼脂糖珠
1.取100μl protein A琼脂糖珠到微量离心管中。
2.用PBS清洗protein A琼脂糖珠3次，每次清洗后在3000r/ min离心5分钟使得protein A琼脂糖珠沉淀下来。
3.加入适量抗体，如0.2mg纯化后的抗体或者200μl血清，并将体积调节到500μl。
4.在室温条件下缓慢摇晃孵育2小时，使抗体与protein A琼脂糖珠偶联。
5.免疫沉淀反应后，在4°C以3000r/min速度离心5分钟，将琼脂糖珠离心至管底。
6.将上清液小心吸去，在室温条件用1ml硼砂溶液洗琼脂糖珠2次，3000r/min离心5分钟，将琼脂糖珠离心至管底。
7.加入1ml Coupling solution，室温缓慢摇晃孵育30分钟。
8.3000r/min离心5分钟，将琼脂糖珠离心至管底。然后，用0.2mol/L乙醇胺洗琼脂糖珠2次。
9.将琼脂糖珠中加入1ml 0.2mol/L乙醇胺溶液缓慢摇晃，孵育2小时，中止coupling反应。3000r/min离心5分钟，将琼脂糖珠离心至管底。
10.用1ml PBS溶液洗琼脂糖珠2次，3000r/min离心5分钟，将琼脂糖珠离心至管底。有时需要再用100mmol/L甘氨酸(pH3.0)清洗琼脂糖珠2次，以去除没有结合到琼脂糖珠上的IgG。
11.将200μl抗体结合的琼脂糖珠加入到上一步获得的细胞裂解液中，缓慢摇晃孵育3～4小时。
三、免疫复合物的亲和纯化
1.将其上孵育的琼脂糖珠用1ml grinding buffer清洗3次，每次以3000r/min离心5分钟回收琼脂糖珠。
2.加20μl2×sample buffer到回收的琼脂糖珠中，在95℃下变性4分钟，在离心机上以最大转速离心30秒沉淀琼脂糖珠。将上清液吸出，短期保存于－20℃备用;如果需要长期保存，放置于－70℃中。
3.取10μl上述样品和10μl全蛋白质样品，SDS-PAGE电泳之后进行Western blot分析。
【注意事项】
1.细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质间相互作用，多采用非离子变性剂(NP 40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，可通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2% SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。
2.使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用。
3.使用对照抗体。单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗;兔多克隆抗体:正常兔IgG。
4.确保共沉淀的蛋白质是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生。
5.要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀。
6.确定蛋白质间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。
【思考题】
1.简述免疫共沉淀的原理。
2.试设计实验，通过Co-IP证明两个蛋白质之间的相互作用。
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