烟草无菌苗的培养

实验三十四　烟草无菌苗的培养

【实验目的】

1.掌握烟草种子消毒技术。

2.掌握烟草种子无菌萌发和无菌苗培养的基本操作技术。

【实验原理】

1.次氯酸钠消毒的原理

次氯酸钠溶液的商品名为“安替福明”，活性氯含量≥5.2%，使用时稀释2～5倍。次氯酸钠溶液浸泡植物外植体5～30分钟(视材料幼嫩程度调整浸泡时间)，再用无菌水洗涤4～5次;它能分解出具有杀菌作用的氯气，灭菌后易于除去，不留残余，杀菌力强;它对植物材料无害，除菌效果好，是植物组织培养常使用的消毒剂之一。

2.乙醇消毒的原理

乙醇具有较强的穿透力和杀菌力，乙醇使细菌蛋白质变性。使用浓度一般为75%;由于细胞容易收缩脱水，所以处理时间不宜太长，一般为30～60秒。它具有浸润和灭菌的双重作用，适用于表面消毒，但不能达到彻底的除菌，必须结合其他药剂配合使用。为了提高乙醇的杀菌效果，可在乙醇溶液中加入0.1%的酸或碱，以改变细胞表面带电荷的性质而增加膜透性，提高乙醇的消毒效果。一般情况下，植物材料先用70%乙醇预处理，然后用次氯酸钠杀菌，可以获得较好的结果。

用于植物材料的消毒液有许多，最常用的试剂见表4-7。

表4-7　常用消毒液使用浓度及效果

烟草是重要的经济作物和工业原料，其体内所含的烟碱等生物碱是非常宝贵的医药及化工原料。烟草也是组织培养和转基因的模式植物。通过本实验建立的烟草无菌苗，可以为利用农杆菌的遗传转化来改良烟草品种和利用烟草细胞培养物进行烟碱等次生物质的生产奠定基础。

【实验内容】

1.烟草种子萌发培养基的配制和灭菌。

2.烟草种子的消毒。

3.烟草无菌苗的培养。

【实验材料和器械】

烟草品种W38的种子、MS培养基母液、激素(2，4-D，KT，6-BA，NAA，IAA)，蔗糖、琼脂、75%酒精、无菌水、50%安替福明水溶液(加入1/1000 TritonX-100)、培养皿、离心管、移液器、量筒、锥形瓶、高温高压灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、光照培养箱等。为了避免赘述，后续相同的设备非一一列出。

【实验步骤】

1.将烟草种子置于75%乙醇中，30秒后用无菌水清洗2～3次;

2.用50%安替福明溶液消毒10～20分钟，之后用无菌水清洗4～5次;

3.将消毒的种子平铺于MS固体培养基上，培养基pH= 5.8，琼脂浓度为0.8%;

4.待长出幼苗后，将幼苗转移到培养盒中继续无菌培养，直到长出若干叶片后备用。

【思考题】

1.无菌苗培养过程中的污染情况:观察接种后3～14天内种子萌发和污染情况，填入表4-8。

表4-8　烟草种子萌发、幼苗形成和污染情况统计

种子萌发率(%)=(萌发的种子数/培养的种子总数)×100%

污染率(%)=(污染的种子数/培养的种子总数)×100%

【注意事项】

如果培养材料大部分发生污染，说明消毒剂浸泡的时间过短;若接种材料虽然没有污染，但材料已发黄，组织变软，不能萌发，表明消毒时间过长，组织被破坏死亡;接种材料若没有出现污染，生长正常，即可以认为消毒时间适宜。

【思考题】

2.种子用消毒剂(安替福明溶液)消毒后，为什么要用无菌水漂洗干净?

3.在安替福民溶液中加入1-2滴的表面活性物质(如TritonX-100)的作用是什么?