水稻种子愈伤组织的培养和幼苗的再生

实验三十五　水稻种子愈伤组织的培养和幼苗的再生

愈伤组织的概念来源于一种自然现象。植物受到机械创伤后在伤口愈合处形成突起的“疤痕”。原因是由于伤口处积聚了大量的营养物质，其中包括促进细胞分裂的因子。同时，由于韧皮部的细胞特化程度不高，在遇到较高浓度的促进细胞分裂的激素和营养物质后，便摆脱约束而分裂。植物生物技术中的愈伤组织指的是在离体条件下，人为诱导的有分裂能力和分化潜力的不定形的细胞培养物。它主要由不断分裂的细胞组成，在体积小时被称为细胞团，体积大时则被称为愈伤组织。愈伤组织形成的条件是植物体中的组织和细胞脱离母体并获得使其分裂而形成愈伤组织。

愈伤组织的用途:①培养愈伤组织以便于大量扩增无性繁殖植株;②培养愈伤组织是保存种质资源的一种方式;③原生质体培养、细胞融合等的起始材料;④转基因操作的受体细胞;⑤悬浮培养、次生代谢物生产的起始材料;⑥离体研究植物组织与细胞的分裂分化、生理代谢及状态转变的最佳材料。

诱导愈伤组织的技术要点:①外植体的选择:选择富含分裂旺盛的细胞和组织作为外植体;②培养基的选择:根据培养材料和组织特点选择适合的、含有丰富营养物质的培养基;③激素的选择:附加生长素(2，4-D等)，以促进细胞脱分化、细胞分裂和细胞生长;附加细胞分裂素(KT或/和6-BA等)，以促使细胞和组织分化而形成不定芽;配合使用细胞分裂素和生长素(IAA等)，以促进不定根的产生。

【实验目的】

1.掌握水稻种胚愈伤组织诱导的原理和方法。

2.掌握水稻愈伤组织再生幼苗的原理和操作技术。

【实验原理】

水稻愈伤组织的培养是利用农杆菌介导的水稻转基因操作的基础。一般情况下，可以采用成熟种子进行诱导，也可以采用水稻幼嫩的胚胎诱导愈伤组织的形成。水稻幼嫩胚可以获得质量良好的愈伤组织，但是由于获取幼嫩胚的过程较之成熟种子要复杂而且费时，对于获得大批量的水稻愈伤组织不太实用;而且，经过研究人员的摸索，已经可以利用成熟的水稻种胚获得高质量的愈伤组织，因此，目前大多采用成熟种胚诱导产生愈伤组织的方法。

【实验材料】

水稻中花11种子。

【药品试剂】

1.安替福民溶液;无菌水; N6培养基母液;各种维生素和激素母液。

2.诱导愈伤组织的培养基(N6):大量元素、微量元素、维生素(灭菌后加入)、铁盐和肌醇等标准用量、500mg/L水解酪蛋白、2.5mg/L 2，4-D、0.8%琼脂粉和3%蔗糖，调节pH值至5.8～6.0，定容至1L，121℃高压灭菌15～20分钟。

3.诱导幼苗分化的培养基(MS):大量元素、微量元素、维生素(灭菌后加入)、铁盐和肌醇等标准用量、水解酪蛋白0.6g/L，2～3mg/L BA，0.2mg/L NAA，0.8%琼脂粉和2%～3%蔗糖，调节pH值至5.8～6.0，定容到1L，121℃高压灭菌15～20分钟。

4.生根培养基(MS):大量元素、微量元素、维生素(灭菌后加入)、铁盐和肌醇等标准用量; 0.6g/L水解酪蛋白、0.8%琼脂粉和2%～3%蔗糖，调节pH值至5.8～6.0，定容到1L，121℃高压灭菌15～20分钟。

【实验方法】

1.取材:选择成熟饱满的水稻种子，剥去种子的外颖和内颖，装入10ml的离心管中。

2.消毒:加入约3m l无菌水清洗3次，75%乙醇浸泡3～5分钟，无菌水清洗3次，再用50%次氯酸钠溶液浸泡20～30分钟，同时，可置于摇床上低速振荡(约100r/min)，以保证获得良好的消毒效果。

3.清洗:在超净工作台上打开离心管，倒出次氯酸钠溶液，用无菌水清洗种子4～5次，将种子倒在灭菌后的滤纸上，超净台上吹干(约30～60分钟)。

4.愈伤组织诱导:将种子转移至添加2，4-D的N6固体培养基上，将种子的胚胎处与培养基接触。10～15粒/9cm平皿，28℃，黑暗条件下培养4周左右。

5.不定芽分化和生根培养:选取种胚处产生的淡黄色、致密的胚性愈伤组织，转入添加细胞分裂素的MS分化培养基中，28℃下光照培养15～20天，可以看到有绿芽长出。当绿芽长到2厘米左右时，剥去周围愈伤组织，转移至1/2MS生根培养基中诱导不定根。图4-1显示的是水稻愈伤组织和再生幼苗。

A.显示水稻愈伤组织; B.显示由愈伤组织诱导出的绿色不定芽;

C.显示由幼芽诱导出的不定根; D.不定根的放大图像。

图4-1　水稻愈伤组织和再生幼苗

6.移栽:将生长有不定根的再生植株转入培养钵中，于背阴处培养4～5天，即可转入大田中培育至成熟。

【思考题】

1.简述植物愈伤组织的概念和用途。

2.简述获得植物愈伤组织的技术要点。

3.简述获得植物愈伤组织不定芽和不定根的技术要点。

附:无菌操作须知

1.操作前的准备工作

接种室在接种前4～5天必须通风换气。在接种前一天对接种室进行全面消毒，一般用40%福尔马林进行全面喷雾，并密闭24小时，然后打开换气窗10～15分钟。

接种前打开超净工作台和侧面的紫外灯照射30分钟;杀菌结束后，先关掉超净工作台上的紫外灯，然后打开超净工作台上的照明灯，即可使用。

2.准备进台

进入接种室前，应先将手表、手镯、戒指、耳环等放在室外，将手和手腕用肥皂洗净后才能进入接种室。

操作前用台内的酒精棉团擦拭手、手腕，再擦超净工作台台面。对于从外面拿进超净工作台的培养瓶等物品，一般需按如下顺序擦拭培养瓶:瓶塞、瓶身、瓶底，彻底擦拭后放于超净工作台台面上。

3.接种操作

剪刀和镊子的消毒:剪刀和镊子用牛皮纸包好后在高压灭菌锅中灭菌。在超净工作台上使用过后将剪刀和镊子分别在酒精灯外焰彻底灼烧，烧时将剪口和镊口张开，烧至剪刀和镊子上部，火焰熄灭后，插回准备好的灭菌的磨口瓶或者架在刀架上放凉备用。切勿将灭过菌的剪刀和镊子在超净工作台上乱放。

用上述消毒过的器械，将切割好的外植体接种至培养基表面。

操作中必须遵守的事项:

(1)棉塞不能乱放。手拿的部分限于棉塞膨大的上半部分，塞入瓶口的那一段始终悬空，并不要碰到其他任何物体;若是螺旋盖或薄膜，则应向下放置在灭过菌的台面上，放置处应随时用酒精棉团涂抹灭菌。

(2)操作人员的头、胳膊等不得进入台内。切记手不要在敞开的瓶口或者是其他无菌的东西上经过，避免细菌、孢子等落入瓶内引起污染。

(3)操作人员不得随意谈话、说笑，以免造成污染。

(4)工作台外人员走动要轻、动作要小。

(5)接种完毕后注意标明接种材料名称、接种日期等。

附表:常用的培养基配方(单位mg/L)

1.MS培养基

2.N₆培养基

3.LB培养基(g/L):大肠杆菌和农杆菌GV3101的培养基

5g/L酵母抽提物; 10g/L蛋白胨; 10g/L NaCl; pH 7.2。

4.YM培养基:农杆菌LBA4404的培养基

0.4g/L酵母提取物; 10g/L甘露醇; 0.1g/L NaCl; 0.1g/L MgSO₄; 0.5g/L K₂ HPO₄; 15g/L琼脂粉，pH7.2～7.4。